流式細胞儀技術概述

流式細胞儀技術，主要是測量群體中單個細胞經適當染色后其成分所發出的散射光和熒光，經染色的細胞在懸液中以單行流過高強度光源的焦點，當每個細胞經過焦點時，發出一束散射光/或熒光。它們經過過濾及光鏡系統收集到達一個光電檢測器(光電倍增管或一個固態裝置)，光檢測器把散射光定量轉化成電信號，經數字轉換器進行數字化后而成整數，然后進行電子存儲，以后數據可以調出顯示和進行分析。其優點如下：

1、具有操作簡便，只要將染色的單個細胞推入儀器中，就會得出數據。

2、具有較高的靈敏度及測定速度，而且每次可測出許多數據，一般情況下，每秒可測5000個細胞，能迅速分析和記數大量細胞，并能準確統計群體中熒光標記細胞的比例。

3、應用廣泛，即可用于測定細胞活力、繁殖周期和細胞定型分析，也可區別死亡細胞、分裂細胞和靜止細胞群，既可測定DNA和RNA、測凋亡峰，又可測蛋白含量，特別是胞漿蛋白。

一、樣品的制備

流式細胞儀是測定一個或重復的每個顆粒經光路的信號，因此，細胞必須做成單個細胞懸浮狀態，不能聚集，也不允許有細胞碎片存在。所用染料必須特異（如特異單抗），而且不允許滲透至載液中。

標本如果是屬于淋巴細胞等血細胞、骨髓細胞或白血病細胞系或類淋巴細胞系，要經Ficoll分離，作單細胞分離處理，但若為實體組織或貼壁生長的上皮成纖維樣細胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、膠原酶等)，化學法（EDTA、EGTA和檸檬酸鹽）消化分散液或洗液最好用無鈣、鎂PBS，檸檬酸鹽的濃度為40μmol/L，并同時采用機械分散法，將經消化處理的膨松組織，用玻璃珠懸搖或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重懸，最好過一下尼龍或不銹鋼網篩100μm和20μm。細胞濃度要保證在1-2×106/mL

若標本用于測定單個細胞，需加入1～5

mg/L的DNAase，將有助于阻止破碎細胞釋放的DNA造成細胞再聚集，但是若分離的細胞要作DNA含量測定之用時，則切勿加DNAase。

二、懸浮細胞的固定

上述制備的活細胞即可用于流式細胞儀分析，如果染色和流式分析要拖后進行，或為了提高染色效果，則要將細胞預固定。乙醇固定是常用的方法。

1、固定方法：

(1)甲醛法：在細胞懸液中加入等量的8%甲醛(用Hank’S液配)4℃下固定12-18小時。

(2)乙醇法：細胞懸于PBS中，緩慢加入-20℃預冷的95%乙醇，使終濃度為70%，冰浴30分鐘。

(3)丙酮法：于細胞懸液中，緩慢加入冷丙酮，使終濃度為85%。

2、實例：

(1)用預冷的無鈣、鎂含0.5mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液，將細胞制成1×106細胞的懸液。

(2)在4℃下逐滴加入3倍體積的95%乙醇，連續攪拌使乙醇終濃度達70%。

(3)該細胞可在4℃下保存數日。

(4)分析前先用1000r/min離心10分鐘，棄去乙醇，再將細胞懸于PBS中或要求的試劑中。