流式細胞儀標本制備熒光標記法

活細胞免疫熒光技術是用于FCM檢測的標本準備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優于滴片固定的常規間接免疫熒光的結果。活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。

細胞懸液

羊抗鼠熒光標記物、DPBS、洗滌液、固定液、甲醛、葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀

玻璃管、離心管、熒光顯微鏡、離心機

制備活性高的細胞懸液(培養細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法)

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用10％FCS　RPMI1640調整細胞濃度為5x10⁶～1x10⁷／ml
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取40ul細胞懸液加入預先有特異性McAb(5～50ul)的小玻璃管或塑料離心管，再加50ul 1∶20(用DPBS

稀釋)滅活正常兔血清

↓4℃ 30min

用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpmx5min

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棄上清，加入50ul工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標記物，充分振搖

↓　4℃ 30min

用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1000rpmx5min

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加適量固定液(如為FCM制備標本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，

視細胞濃度加入100～500ul固定液)

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FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察(標本在試管中可保存5～7天)

1、整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaN₃，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發生交聯、脫落。

2、洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性。

3、加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

4、細胞活性要好，否則易發生非特異性熒光染色。

流式細胞儀的特征：

1. 靈敏度高 ；

2. 速度快；

3. 多參數分析（可同時標記多種熒光素）；

4. 單細胞水平上的分析；

5. 需要樣本量少；

6. 出結果快；

7.標本來源廣。