流式細胞儀檢測技術操作方法

　　一、 細胞和試劑的準備

　　1. 細胞樣品：來源淋巴細胞或外周血的白細胞。

　　2. 熒光標記單克隆抗體：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）標記的單克隆抗體。

　　3. 封閉抗體：抗Fc受體抗體

　　4. FACS緩沖液：

　　1xPBS 950 ml

　　FCS 40 ml

　　10%疊氮鈉溶液 10 ml

　　5. 儀器緩沖液（FACS-flow）：儀器廠家提供

　　6. FACS清潔液（FACS clean ）和FACS洗凈液（FACS rinse）：儀器廠家提供。

　　二、操作步驟

　　1. 單細胞懸液的制備：將1x105~1x107的細胞放入1.5 m l離心管中3000 r/min 離心5分鐘，棄上清；加入FACS緩沖液100 ul 懸浮細胞。

　　2. 封閉細胞表面Fc受體：在步驟1中加入Fc受體抗體0.5 ul（0.5 mg/ml），水浴3分鐘。

　　3. 細胞與熒光抗體結合：在步驟2中加入熒光抗體1 ul（0.5 mg/ml），水浴30分鐘。

　　4. 洗細胞去除游離的熒光抗體：在步驟3中加入FACS緩沖液350 ul，輕輕混勻，3000 r/min，離心5分鐘，棄上清，重復步驟（4）2次。

　　5. 上樣前處理：取100 ul 儀器緩沖液加入步驟（4）獲得的細胞沉淀中，輕輕混勻懸浮細胞，將細胞懸液移入FACS專用管中，準備進行儀器檢測和分析。

　　三、儀器的操作

　　以FACSCaliburTM（BD Biosciences）儀器為例。儀器主要分為主機部分（包括激光激活源，射流，射線探測器）和計算機部分（CELLQuest softwere）。儀器的操作分為使用前的準備、使用中的操作和使用后的清洗。

　　1.使用前的準備

　　（1）打開電源：包括系統電源和主機部分電源。

　　（2）檢查供液槽和廢液槽：供液槽應含足夠的儀器緩沖液，廢液槽應在上次使用后清洗干凈。

　　（3）使機器處于負亞狀態，才能使細胞懸液被吸入至機器的吸管口。

　　（4）機器處于可應用狀態時，指示燈會變成綠色。

　　2.使用中的操作

　　（1） 計算機部分&mdash；使用CELLQuest程序系統軟件：

　　①設定所要檢測細胞的數量：一般設10 000~20 000個細胞。

　　②命名本次實驗：一般含使用者的姓名和實驗日期。

　　③打開記數部分：顯示進入的細胞數以及檢測一定量的細胞所需要的時間。

　　④將微機與主機連接：控制檢測時的預檢測和實際檢測。

　　⑤主機設定：一般是已設定好的適合測定淋巴細胞的條件，包括探測器的電壓。探測器的電壓是調空光電倍增管所能檢測熒光密度的范圍。

　　⑥選擇檢測的波長和表達方式（plot）：如果用一種熒光抗體，一般選直方圖（histogram）；如果用兩種熒光抗體，常選點狀二維圖（dot plot）或輪廓線圖（contour plot）

　　（2）細胞的吸入：將裝有細胞的FACS測定管放置到機器吸管孔處。

　　先預檢測樣品，然后進行實際檢測。可根據細胞的濃度選擇測定的速度（低、中或高）。所有的數據將自動存入微機。

　　3.使用后的清洗 所有樣品測定完后，要進行儀器的清洗。

　　（1）將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入1分鐘。

　　（2）將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入 1分鐘。

　　（3）再將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入5分鐘。

　　（4）同樣再將裝FACS洗凈液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入5分鐘。

　　（5）最后將一裝有雙蒸水的FACS管放置機器吸管孔后，關閉機器。

　　（6）將廢液槽中的廢液倒掉，并清洗干凈廢液槽。