流式細胞儀檢測細胞凋亡方法(AnnexinV法)

實驗原理

Annexin V是檢測細胞凋亡的靈敏指標之一。它是一種磷脂結合蛋白，可以與早期凋亡細胞的胞膜結合，而細胞質膜的改變是細胞發生凋亡時最早的改變之一。在細胞發生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸(PS)由質膜內側翻向外側。Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，因而與細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸結合。由于在發生凋亡時，磷脂酰絲氨酸外翻的發生早于細胞核的改變，因此，與DNA碎片檢測比較，使用Annexin V可以更早地檢測到凋亡細胞。因為細胞壞死時也會發生磷脂酰絲氨酸外翻，所以Annexin V常與鑒定細胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，來區分凋亡細胞(Annexin V /核酸染料-)與死亡細胞(Annexin V /核酸染料 )。

實驗試劑

1. PBS緩沖液：含0.1%NaN₃ ，過濾后2-8°C保存。

2. Annexin V Binding Buffer緩沖液(Cat. No. 66121E)：濃度為10×，使用時，用稀釋為1×濃度的應用液。

3. Annexin V試劑與核酸染料：

Annexin V                                                   核酸染料

Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X)          PI(Cat. No. 66211E)或

Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D)          7-AAD(Cat. No. 34321X)

Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X)            PI(Cat. No. 66211E)

Annexin V-PE(Cat. No. 65875X)                7-AAD(Cat. No. 34321X)

實驗設備

1. 一次性12×75mm Falcon試管。

2. 微量加樣器和加樣頭。

3. FACS流式細胞儀：上樣檢測。

4. CELLQuest軟件：獲取和分析試驗數據。

5. Annexin V檢測對照管：

Annexin V    A-陰性對照    B-補償1                                       C-補償2

Biotin           SAv-FITC       Annexin V-Biotin和SAv-FITC    PI和SAv-FITC

PE                未染色細胞     Annexin V-PE                              7-AAD

FITC           未染色細胞      Annexin V-FITC                           PI 

實驗步驟

1. 取Falcon試管，按標本順序編好陰性對照管和標本管號。

2. 使用冷的PBS緩沖液洗細胞兩次，再用1× Binding Buffer緩沖液制成1×10⁶ 細胞/ml的懸液。

3. Falcon試管中加入100 μl細胞懸液。

4. 按以下體積加入Annexin V與核酸染料：

    管號  名稱        熒光標記Annexin V  核酸染料

    1     陰性對照     -                                 -

    2     單陽1        AV-FITC                      -

    3     單陽2          -                                  PI

    4     樣本          AV-FITC                     PI

5. 輕輕混勻，室溫(20°C ~25°C)避光處放置15分鐘。

6. *使用Annexin V-Biotin試劑進行檢測時：

1×Binding Buffer緩沖液洗細胞一次，去上清。

1×Binding Buffer緩沖液100μl溶解SAv-FITC試劑0.5μg，加入到細胞管中。

輕輕混勻。

加入5μl PI，室溫(20-25°C)避光處放置15分鐘。

7. 各試驗管中分別加入1×Binding Buffer緩沖液400μl。

8. 1小時內上流式細胞儀測定結果。