1. 96 孔板樣本處理
1.1 操作流程
接種細胞：3×104 /孔 藥物刺激 一般作用24 小時，上機
1.2 方法
在cellquest 環境下，利用control 細胞標定上樣條件，并在已設好的文件
夾(INS 文件及SET 文件)下，保存好需要的上樣文件 關閉cellqest 軟件，
打開MPM 軟件 在MPM 軟件下進行一系列設定(首先在Autosample 下，
進行SettingInitial 及FinalWashing 操作，清洗整個管路 管路清洗完畢進行
上樣條件設定(主要設定上樣體積(一般100ul)，混合體積(一般100ul)，混合次數，
清洗次數等，在Acquisition 菜單下設定current plate(現在使用的板號是353263)，
DateStorageFolder( 即數據儲存文件夾) ， AcquisitionDocument 及
InstrumentSettingsFile(上樣條件從保存好的INS 及SET 文件中選定) 上樣
條件設定完畢，選定96 孔板的上樣范圍 在Acquisition 下選擇Acquire,
上樣 上樣完畢，退出上樣板，使用次**鈉及水，清洗管路(將次**鈉
及水加在96 孔板上，以上樣的方式清洗管路)
*須知：如果使用PBS 作為上樣鞘液，上樣完畢后，換用水作為鞘液，并反復沖
洗管路，防止PBS 鹽結晶堵塞管路。
1.3 注釋
1) 必需的control：應準備一管對于檢測指標為陰性的細胞(例如：若要檢測
Jurkat-NF-KB-GFP 經藥物刺激樣本，就需要準備一管Jurkat 細胞(GFP 為陰
性))，用于標定機器的上樣條件。細胞量為1×106 個/ml，1ml。
2) 上機前，應對樣本進行混合，以使樣本均一(注意使用排槍吹打，勿產生氣泡)。
3) 以上protocol 僅針對于懸浮細胞。
4) 藥物刺激濃度需先做梯度檢測。
第七章 流式細胞分析分選術
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2. Cell Cycle Assay
常用的實驗細胞株包括：293(T)，MCF7，U2OS，Saos，Hela 等
以U2OS 細胞為例
2.1 細胞培養及鋪板
1) 細胞株及材料：
a) 細胞株： U2OS 細胞
b) 培養基： DMEM(10%FBS，GBICO)，DMEM(無血清)
c) 培養器皿：75cm2 培養瓶,6cm 培養皿
2) 細胞培養及鋪板：
a) 傳代：用DMEM(10%FBS) 培養基接種U2OS 至75cm2 培養瓶，細胞長
滿后鋪板并傳代。
注：一般一瓶細胞總數可以達到1×107 個
b) 鋪板：
細胞消化：將培養好的U2OS 細胞，傾去培養基，加入2ml 1×胰酶輕輕
搖晃以覆蓋整瓶細胞，37℃培養箱放置2-3min，觀察細胞從
瓶壁上脫落下來(也可以用手拍擊瓶壁)，顯微鏡下觀測到細胞
成單個，或是只有2-3 個細胞聚團，即可以加入5ml 含有血清
的DMEM(10%FBS)，終止胰酶的消化作用。
細胞計數：如果細胞密度較大，可按一定倍數稀釋后計數。
細胞密度(單位：個/ml)=(4 個大方格的細胞總數/4)×104×稀釋倍數
鋪板： 6cm培養皿按照每孔6×105 個細胞(即1.5×105/ml，4ml)
細胞加入后將6cm 培養皿沿水平面桌面的方向前后左右來回晃動
(手勢一定要輕柔,防止培養液潑出)，使細胞能夠均勻分布，放置細
胞培養箱生長。
注：計算鋪板量時，應將control 板，藥物陽性對照板及質粒對照板考慮在內。
第七章 流式細胞分析分選術
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2.2 轉染
1） 試劑及材料：
a) 轉染試劑：Lipofectamin 2000
b) 質粒：對照質粒：pEF-BOS
p21(陽性對照)
p16(陽性對照)
GFP-spectin
目的基因質粒，構建在pEF-FN 載體上
注：若目的基因載體不是pEF-FN,則對應的空載體要相應變化。
2） 轉染：細胞密度為50%-60%時，進行轉染
A：0.3μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至終體積500μl/
孔。
B：9.9μL lipofectamine 2000+490.1μL serum free DMEM 體積為500μl /孔，室
溫放置5min
A，B 二者混合，室溫放置20-30min 后將混合液緩慢而均勻的加到6cm 板
細胞液中，每板為1000μL，輕輕搖晃，使DNA 分布均勻，轉染5 小時后，
換置培養液(10%FBS+DMEM)。
2.3 細胞分板
細胞分板：轉染12-16 小時后, 根據細胞密度按1：3 或1：2 分板，使分
板后細胞密度為30%左右,37℃繼續培養30h。
2.4 加藥刺激
除了利用轉染質粒作為陽性對照，也可使用藥物處理細胞作為陽性對照樣本
細胞鋪板24 小時后，加藥刺激：
G1，S-arrest ：L-mimosine: 0.5mM
5-fluorourcil: 10mM
G2/M arrest : nocodazole: 50ng/ml
第七章 流式細胞分析分選術
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加藥后，繼續培養24 小時
附注：作為陽性對照的基因及藥物的具體使用情況見附表1。
2.5 細胞收獲及處理
分別收集培養液，在每個6cm 板中加入1ml 胰酶消化(細胞消化的方法同上)。
消化完畢，加入已收集的培養液(注意一一對應，防止弄錯)中和胰酶。離心(300g，
5min)收集細胞，棄上清，加入2-3ml 75%乙醇(細胞量較多，可酌量多加)，votex，
充分混勻，放入-20oC 冰箱，保存。
2.6 上機樣本制備
從-20oC 取出細胞樣本(至少已在-20oC 放置4 小時)，離心(300g，5min)收集細
胞，棄上清。1×PBS 清洗兩遍，加入100ul 1×PBS，votex 混勻，加入10ulPI(終