流式細胞技術精彩回顧

分子生物學主要致力于對細胞中不同系統之間相互作用的理解，包括DNA，RNA和蛋白質生物合成之間的關系以及了解它們之間的相互作用是如何被調控的。而流式細胞儀是測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現代分析技術。與傳統的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優點。

技術簡介

流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，是一種在液流系統中，快速測定單個細胞或細胞器的生物學性質，并把特定的細胞或細胞器從群體中加以分類收集的技術。其特點是通過快速測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來定量測定細胞 DNA含量、細胞體積、蛋白質含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等許多重要參數。根據這些參數將不同性質的細胞分開，以獲得供生物學和醫學研究用的純細胞群體。目前最高分選速度已達到每秒鐘3萬個細胞。

工作原理

將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區域。

流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。

這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過模/數轉換器，將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結果顯示在計算機屏幕上，也可以打印出來，還可以數據文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。

檢測數據的顯示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為細胞數目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數，這視其模數轉換器的分辨率而定。對于雙參數或多參數數據，既可以單獨顯示每個參數的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。

細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現細胞的分離。

發展歷程

流式細胞儀從細胞技術開始發展到今天，60年代至70年代是其飛速發展時期。 激光技術、噴射技術以及計算機的應用使流式細胞儀在原理和結構上形成了固定的模式。

80年代則是流式細胞儀的商品化時期，這期間不斷有新型號的儀器推出，在多參數檢測技術上不斷提高。

進入90年代，隨著微電子技術特別是計算機技術的發展，計算能力不斷提高，流式細胞儀的功能也越來越強大。在數據管理、數據分析方面有了長足進步。但是，在技術原理和設計方面并沒有突破性的進展。人們的注意力開始轉向流式細胞儀的應用，新的熒光探針、新的熒光染料、新的染色方法不斷推出，使流式細胞技術在新的細胞參數分析方面日益發展。

從新推出的儀器看，流式細胞儀會在硬件上不斷更新，采用更新的器件（如半導體激光、大規模集成電路），以實現小型化；用數字電路取代模擬電路，充分發揮微處理器的功能以實現簡單化；在軟件上提高數據自動分析能力，充分發揮圖形界面的優點，使操作更加簡便。

技術應用

隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經從科學研究走入了臨床應用階段，在我國臨床醫學領域里已有著廣泛的應用。可用于白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定，以及免疫學研究，并已開始用于細菌鑒定，病毒感染細胞的識別和艾滋病感染者T4、T8細胞的記數。

自70年代以來，隨著流式細胞技術水平的不斷提高，其應用范圍也日益廣泛。流式細胞術已普遍應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫學和基礎醫學研究領域。

在腫瘤學中的應用

這是FCM在臨床醫學中應用最早的一個領域。首先需要把實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液，用熒光染料(碘化吡啶PI)染色后對細胞的DNA含量進行分析，將不易區分的群體細胞分成三個亞群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表細胞的倍體狀態，非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。

(1)發現癌前病變，協助腫瘤早期診斷：人體正常組織發生癌變要經過一個由量變到質變的漫長過程，而癌前細胞即處于量變過程中向癌細胞轉化階段。人體正常的體細胞均具有比較穩定的DNA二倍體含量。當人體發生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時，在其發生、發展過程中可伴隨細胞DNA含量的異常改變，FCM可精確定量DNA含量的改變，作為診斷癌前病變發展至癌變中的一個有價值的標志，能對癌前病變的性質及發展趨勢作出估價，有助于癌變的早期診斷。有資料證實，癌前病變的癌變發生率與細胞不典型增生程度有密切關系，增生程度越重，癌變發生率越高。隨著細胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍體出現率增高，這是癌變的一個重要標志。

(2)在腫瘤的診斷、預后判斷和治療中的作用：FCM在腫瘤診斷中的重要作用已經被認可，DNA非整倍體細胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力的依據，FCM分析病理細胞具有速度快、信息量大，敏感度高等優點，已被用在常規工作中。腫瘤細胞DNA倍體分析對病人預后的判斷有重要作用，異倍體腫瘤惡性病變的復發率高、轉移率高、死亡率也高，而二倍體及近二倍體腫瘤的預后則較好。

FCM不僅可對惡性腫瘤DNA含量進行分析，還可根據化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效，了解細胞動力學變化，對腫瘤化療具有重要的意義。臨床醫師可以根據細胞周期各時相的分布情況，依據化療藥物對細胞動力學的干擾理論，設計最佳的治療方案，從DNA直方圖直接地看到瘤細胞的殺傷變化，及時選用有效的藥物，對瘤細胞達到最大的殺傷效果。

此外FCM近幾年還被應用于細胞凋亡和多藥耐藥基因的研究中。醫學工作者開始研究如何用藥物誘導癌細胞死亡。通過對細胞體積、光散射、DNA含量及特異性抗原基因(如bcl-2, Fas等)測定分析出細胞凋亡情況。多藥耐藥是腫瘤病人化療失敗的主要原因，FCM對多藥耐藥基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定，可為臨床治療效果分析提供有力依據。

在血液病診斷和治療中的應用

FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對各種血液病的診斷、預后判斷和治療起著舉足輕重的作用。

(1)白血病的診斷和治療：FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原(CD)的單克隆抗體，借助于各種熒光染料(異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等)測定一個細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種急性白血病的診斷和鑒別診斷有決定性作用。

同其它腫瘤的治療一樣，測定DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應藥物可以提高療效。

目前臨床除化療藥物治療外還采用造血干細胞移植技術治療急性白血病和一些疑難性疾病。FCM通過對人白細胞抗原(HLA)配型的測定可以為異體干細胞移植病人選擇出最合適的供體。造血干細胞移植技術主要包括干細胞的鑒別、活性測定、干細胞動員和采集、分離純化、保存擴增、腫瘤細胞的凈化、干細胞回輸以及術后保持移植物抗宿主病的低發生率等一系列過程。FCM測定CD34、HLA-DR、CD33等細胞表面標志物，成為干細胞移植技術重要的監測手段。用FCM檢測一系列指標觀察病人的恢復狀態，可以對預后做出早期的判斷。

(2)其它種類血液病的診斷和治療監測：陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥是一種造血干細胞克隆病，細胞CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。該抗原屬于血細胞表面磷脂酰肌醇錨連蛋白家族，是重要的補體調節蛋白，它通過與補體C8、C9的結合以阻止補體膜攻擊復合物的形成，從而抑制細胞被補體激活溶解。FCM采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞CD59的表達做定量分析，可以協助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程。

(3)網織紅細胞的測定及臨床應用：網織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標，FCM通過某些熒光染料(吖啶橙、噻唑橙等)與紅細胞中RNA結合，定量測定網織紅細胞中RNA，得到網織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。有作者報道FCM方法比目測法結果精確度更高。此外FCM還可以測量出網織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義。為干細胞移植術后恢復的判斷、貧血的治療監測、腫瘤病人放化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據。

在血栓與出血性疾病中的應用

(1)血小板功能的測定：正常情況下血小板以分散狀態在血管內運行，但當血管損傷、血流改變或受到化學物質刺激時血小板被活化而發生一系列改變。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達水平的高低來判斷，FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況成為檢查血小板功能的一種新手段。該方法靈敏、特異性高。如果采用全血法測定，只需微量標本，適合于兒童及血小板減少性疾病的患者。血小板活化時其質膜糖蛋白較其靜止期發生顯著改變，FCM可以通過單抗免疫熒光標記(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)監測血小板功能及活化情況，有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療。此外血小板活化時其細胞內的鈣離子濃度發生很大變化，借助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監測的非免疫性指標。

(2)血小板相關抗體的測定：免疫性血小板減少性紫癜病人血漿中可產生血小板自身抗體，結合在血小板表面，稱為血小板相關抗體，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標記被測血小板，FCM可以測定血小板相關抗體含量。直接法檢測血小板表面的相關抗體，間接法可測定血清中的相關抗體。該方法用于該病的診斷及治療監測，具有檢測速度快、靈敏度高的優點。

未來展望

流式細胞技術

目前，FCM是定量外周血中HPC的參考方法，廣泛應用于外周血干細胞移植實驗室，用于決定PBSC采集的時機及評價外周血采集液的收益。其基本原理為熒光免疫分析，即根據外周血與骨髓中HPC表達同樣的CD34抗原(CD34+)，并利用熒光標記CD34抗體與HPC膜表面CD34抗原結合，在特定波長的激光照射下，檢測CD34+胞發出的熒光強度并結合其光學特性，即較低的側向散射（SSC）和較高的前向散射（FSC），從而檢測CD34+細胞。CD34+細胞實際上包括所有的HPC，如CFU-GM，紅細胞暴發形成單位(BFU-E),巨核細胞形成單位（CFU-Mk）,混合細胞集落形成單位（CFU-Mix）和原始細胞集落形成單位（CFU-Blast）。后兩種HPC明顯具有許多干細胞的特征，如它們可以自我更新，也可定向分化為一定數目的造血細胞系。體內試驗也發現，經過致死劑量照射的狒狒移植足夠數量的自體CD34+細胞，可以完全恢復其造血功能，同樣的現象也可在經過骨髓、摧毀性治療的病人中出現。有人認為，CD34+細胞在功能上可根據是否表達CD33抗原而分為2個細胞群。早期的HPC，如CFU-Blast和LTC-IC僅表達Q CD34抗原（CD34+/CD33-），而較為成熟的定向祖細胞可同時表達CD34和CD33抗原（CD34+/CD33+）。還有人根據CD38抗原表達與否，將CD34+細胞分為CD34+/CD38-和CD34+/CD38+兩個亞型，并且認為LTC-IC主要分布于CD34+/CD38-亞型，而更為原始的ELTC-IC則僅分布于CD34+/CD28-細胞群，說明CD34+/CD38-亞型性質上更接近PBSC。

回顧性資料表面，移植經歷了與移植物中不同分化程度的HPC有關的兩個階段。起初，與早期造血恢復有關的是移植 物中定向祖 細胞（committed progenitor cell）；繼之，持續性的移植 相由多能造血干細胞產生。因此，周血中不同分化程度的HPC，對指導干細胞采集及移植成功尤為必要。目前多參數及雙參數流式細胞低度均可通過CD34、CD33和CD38抗體等檢測標本中不 同CD34+細胞亞型，來決定采血的時機和預測移植效果。Barnett等報道，采集液CD34+細胞數量與外周血中CD34+細胞百分率顯著相關（r=0.71），并且認為準確計數循環中CD34+細胞，可更好地預測采集液中造血干/祖 細胞含量。Weaver等觀察692例患者外周血祖細胞（PBPC）采集液中CD34+細胞、單個核細胞、集落形成單位的數量與移植動力學關系，認為PBPC采集液中CD34+細胞含量是預移植后中性粒細胞和血小板數量回升最有力的指標。

雖然，FCM測定CD34+細胞是檢測HPC數量的參考方法，但仍有一些技術問題有待解決：（1）單平臺分析代替傳統雙平臺分析的可行性；（2）應對單平臺FCM分析實驗室進行多中心的橫向研究；（3）標本制備方法；（4）確定引起移植后快速和長期造血功能恢復的不同干細胞亞型及移植所需數目等。此外，FCM法需特殊儀器，操作技術要求高，價格昂貴，結果的重復性欠佳，促使人們追求更經濟、快捷、簡便的方法。