流式細胞術常用樣品的制備方法

實驗概要

流式細胞術的實驗檢測對象是單細胞懸液，因此，在組織化學和免疫組織化學實驗中欲對待測樣品細胞進行分類計數，也需把樣品制備成細胞懸液，并要求被檢細胞大小為0.2～80pm，每個樣品中至少有20 000個細胞，細胞濃度為10⁵～10⁷個／ml。制備成的單細胞懸液經熒光或免疫熒光標記即可上機檢測。本實驗介紹了單層培養細胞單細胞懸液、實體組織單細胞懸液及石蠟包埋組織流式細胞樣品的制備流程。

主要試劑

0.25％胰蛋白酶，無鈣離子和鎂離子的PBS液，70％乙醇，l％胃蛋白酶溶液

主要設備

倒置顯微鏡，培養瓶，吸管，離心管，4℃冰箱，剪刀，勻漿器，不銹鋼網，流式細胞儀

實驗步驟

1. 單層培養細胞單細胞懸液的制備

   1) 棄去培養細胞(對數生長期)中的舊培養液，加入1～2ml 0.25％胰蛋白酶，倒置顯微鏡下觀察，見細胞稍變圓時，停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養瓶，靜置消化2～3分鐘，待細胞逐漸變白，有脫落趨勢時，立即豎立培養瓶，停止胰蛋白酶作用，棄去胰蛋白酶；

   2) 加入3～4ml無鈣離子和鎂離子的PBS液，用吸管反復吹打，使其分散為單個細胞懸液，移人離心管中；

   3) 離心，去掉上清液，加入約0.5mlPBS液，用振蕩器使細胞分散；

   4) 用細滴管或注射器將細胞迅速注入4℃ 70％乙醇中，保存于4℃冰箱中備用。

2. 實體組織單細胞懸液的制備

   1) 機械法

      a. 用剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織；

      b. 將剪碎的組織加入勻漿器中勻漿；

      c. 用吸管或注射器抽吸細胞懸液，以分散細胞；

將細胞懸液在尼龍網或不銹鋼網上過濾，濾出的細胞懸液細胞計數后即可使用。

   2) 酶處理法

此法是實體組織分散為單個細胞的主要方法。由于不同酶對細胞內和細胞間不同組分有特異消化作用，所以應根據所用組織類型確定使用酶的種類。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能結合組織中的二價鈣離子和鎂離子，而二價鈣離子和鎂離子有維持細胞表面完整性和維持細胞間質結構的作用，因此，幾種酶和EDTA聯合使用有助于充分消化實體組織，提高細胞產出效率。下面僅介紹組織消化的一般過程，對于每種組織消化時所用的具體步驟需參考該組織細胞培養時的消化方法。

      a. 將組織剪成l～2mm³左右的小塊。

      b. 用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊，胰蛋白酶適用于消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織。胰蛋白酶工作濃度一般為0.1％～0.5％。對于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用0.25％膠原酶，膠原酶對組織中膠原蛋白類結構消化作用強，它僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。膠原酶常用劑量為0.1～0.3ug／m1。用大于組織量30～50倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在37℃條件下消化組織，需每隔一定時間搖動一次。消化時間的長短依組織類型而定，一般來說，胰蛋白酶需作用20～60分鐘，膠原酶需4～48小時。在消化過程中，如發現組織塊已分散而失去塊的形狀，經搖動即可成為絮狀懸液，則可取出少量液體在顯微鏡下觀察，可見分散的單個細胞和少量的細胞團，可認為組織已消化充分。

      c. 消化完畢后，將細胞懸液通過100目孔徑尼龍網或不銹鋼網濾過，以除掉未充分消化的組織。

      d. 已過濾的細胞懸液經800～1000rpm低速離心5～10分鐘后，棄上清液，加PBS液，輕輕吹打形成細胞懸液，細胞計數后即可使用。

3. 石蠟包埋組織的流式細胞樣品制備外科手術獲得的新鮮實體組織，往往已進行石蠟包埋處理，如果再制成細胞懸液進行流式細胞分析，需將石蠟包埋組織進行以下步驟的處理：

   1) 將石蠟包埋的組織塊切成30／xm厚的切片，盡可能除去切片中石蠟成分；

   2) 將切片置于離心管中，用二甲苯脫蠟2次，10分鐘／次；

   3) 蒸餾水洗2次后，加入lml l％胃蛋白酶溶液中(pH1.5)，37℃恒溫振蕩水浴中消化30分鐘；

   4) 離心，所獲得的細胞沉淀可進行染色和流式細胞術分析