5 疾病基因多態性研究的臨床應用
長期以來臨床上就認識到，同一種疾病其臨床表現、對治療的反應及預后在不同個體間都存在著顯著的差異。例如，在糖尿病患者中并不是所有的患者都會發展為糖尿病腎病，只有約40％的糖尿病患者伴發糖尿病腎病；動脈粥樣硬化患者心腦合并癥的發生率也存在很大的個體差異；慢性腎炎中的IgA腎病，不僅臨床表現多樣，而且預后相差懸殊，其中只有20％～30％的患者較快地發展為腎功能衰竭等。在對許多藥物治療的反應性上個體之間也存在著很大差異。即便是療效最好的藥物也只對大約80％的患者有效。有許多藥物僅對20％的患者有幫助。現已查明，疾病基因多態性是造成這些差異的重要原因。
人類最早研究基因多態性與疾病的關系是從組織相容性抗原(HLA)基因入手的。這類研究試圖通過比較HLA基因不同位點等位基因在特定疾病患者和正常人群中的分布規律，來分析HLA基因型在疾病發生易感性方面的作用。在過去近20年中，國內外有大量有關這方面研究的報道，研究范圍涉及到臨床醫學多個領域，已發表的研究工作可以開列出一長串HLA基因多態性與多種疾病，尤其是與一些自身免疫性疾病的發生相關的疾病。其中比較有代表性的成果是證明了HLA基因B27等位基因與強直性脊柱炎的發生明顯相關。這些研究由于只是說明了某些疾病的易感人群，對疾病的病理生理、發病機制以及防治干預措施幫助不大，因此其應用受到了限制。
真正奠定基因多態性臨床研究工作基石的是Rigat在1990年有關血管緊張素轉換酶（ACE）基因多態性的研究，他首次證實ACE基因多態性不同基因型個體血清中，ACE活性存在著差異。ACE是體內血管緊張素Ⅰ轉化形成血管緊張素Ⅱ的一個重要限速酶。ACE基因第16號內含子中存在缺失（D）和插入（I）多態性，在人群中可以表現為DD純合子、II純合子和DI雜合子。Rigat的工作證實，人群中ACE基因DD型者其血清中ACE活性最高，DI型次之，而II型最低。這項工作首次從基因水平揭示了人類不同個體間，體內生物活性物質的功能及效應可能存在差異的本質，從而為探討疾病臨床表現在不同個體間的差異及對治療反應性不同的內在因素開辟了一條新的途徑。腎素-血管緊張素系統在維持人體內多種內穩機制中起著重要作用。ACE基因多態性的上述特點使它一時間成為心血管疾病、腦血管疾病、糖尿病和腎臟疾病等相關領域研究的一個熱點課題。腎素-血管緊張素系統在其級聯反應過程中有四個關鍵基因參與，即腎素基因、ACE基因、血管緊張素原基因和血管緊張素Ⅱ受體基因。近年來圍繞上述4個基因進行的一系列研究，使人們的認識更趨系統和具有整體概念。
目前，有關疾病基因多態性的研究已經涉及到很多領域。例如，凝血因子V基因多態性與血栓形成的關系；胰島素基因多態性與1型糖尿病的關系；Ⅰ型膠原α1鏈基因多態性及維生素D受體基因多態性與骨質疏松的關系；載脂蛋白基因多態性與動脈粥樣硬化的關系；雌激素受體基因多態性與乳腺癌及骨質疏松的關系；P53抑癌基因多態性與腫瘤發生及轉移的關系等。盡管這類研究還能列舉很多，但是，其研究的重點大都局限于分析一些目的基因多態性與疾病發生的相關性聯系，缺乏根據基因型對疾病的一些亞臨床表型的分析和研究，有很多工作忽視了對基因多態性與其功能之間聯系這一重要環節，從而削弱了這類研究的臨床實際應用價值。在過去的4年里，我們開展了一系列腎臟疾病基因多態性的研究，取得了一些新成果。下面擬通過我們自己的工作，以兩個候選基因為例，對疾病基因多態性的研究思路進行闡述，并對疾病基因多態性研究的策略及今后的發展前景提出看法。
6 利用葡萄糖轉運蛋白-1（GLUT1）基因多態性探索糖尿病腎病發病機制及其防治
在生物體內，葡萄糖無法自由通過細胞膜脂質雙層結構進入細胞，細胞葡萄糖的攝入需借助細胞膜上葡萄糖轉運體。葡萄糖轉運蛋白是調控細胞內糖攝入及糖代謝的第一道關卡，在介導糖尿病臟器損傷中起非常重要的作用。人類腎小球系膜細胞上有GLUT1的存在，系膜細胞在接受GLUT1基因轉染后，這種過度表達GLUT1基因的系膜細胞，在生理糖濃度培養條件下，將表現出正常細胞只有在高糖培養基中才表現出來的細胞肥大和細胞外基質產生增加等改變。這就表明，系膜細胞GLUT1的功能狀態對糖攝入的影響在某些情況下可能較細胞外糖濃度起更重要的作用。因此，糖尿病患者不同個體間腎臟系膜細胞GLUT1功能調控上的差別，有可能是部分患者易患腎臟損害的重要因素。鑒于上述事實，我們設想GLUT1是研究糖尿病腎病一個理想的候選基因。GLUT1基因在其第2號內含子限制性內切酶Xba識別序列中存在一個點突變，發生點突變的等位基因其XbaⅠ酶切點消失。因此，根據攜帶該點突變等位基因的不同，在人群中GLUT1可以表現為三種不同的基因型：XbaⅠ（＋／＋）、XbaⅠ（＋／－）和XbaⅠ（－／－）。我們對GLUT1基因型在糖尿病及糖尿病腎病患者中的分布進行了研究，發現XbaⅠ（－）等位基因的攜帶率在糖尿病腎病患者中明顯高于糖尿病無腎病的患者，同時也比正常人群高。這一結果初步表明，GLUT1基因多態性與糖尿病腎病的發生有關，攜帶XbaⅠ（－）等位基因的糖尿病患者較不攜帶該等位基因者更容易發生糖尿病腎病。在這個基礎上，我們又利用患者皮膚上的成纖維細胞，進一步研究了GLUT1基因型對其功能的影響。從GLUT1不同基因型個體獲取皮膚標本，在體外進行成纖維細胞培養，比較GLUT1不同基因型成纖維細胞GLUT1功能的差異，發現攜帶GLUT1基因XbaⅠ（－）等位基因者，其成纖維細胞對葡萄糖的攝入明顯高于不攜帶該等位基因者，主要表現為細胞GLUT1的親合性增加，證實了GLUT1不同基因型個體細胞糖代謝確實存在著差異。這就從細胞功能上論證了具有GLUT1基因XbaⅠ（－）等位基因型的糖尿病患者容易罹患糖尿病腎病的可能機制。在臨床上這種基因類型者應該被視為是發生糖尿病的高危因素。GLUT1基多態性的研究，不僅揭示了GLUT1不同基因型個體在糖尿病腎病發病率上的差異，而且也為尋找治療糖尿病腎病的藥物奠定了基礎。我們的進一步體外實驗表明，人腎小球系膜細胞GLUT1的表達受轉化生長因子-β1(TGF-β1)的調控。TGF-β1能夠增加系膜細胞GLUT1 mRNA的表達和糖攝入。中藥大黃酸能夠明顯拮抗TGF-β1的上述作用，抑制系膜細胞GLUT1的過度表達。根據這一觀察結果，我們設計了利用大黃酸治療早期糖尿病腎病的方案。經過一年的隨訪在臨床上證明了這一療法的效果。
7 根據白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1ra）基因多態性研究，揭示了IgA腎病與紫癜性腎炎的聯系
IgA腎病是我國慢性腎小球腎炎中最常見的一種類型，其發病率約占我國原發性腎炎的1／3。長期的臨床觀察表明，IgA腎病不是一個均一的疾病實體，臨床上可分為不同的亞型，不同亞型臨床表型患者在免疫病理、臨床表現和對治療的反應及預后上均有所不同。其中尤以臨床上表現為反復發作性肉眼血尿者特征明顯，而且在臨床和病理上與紫癜性腎炎有很多相似之處。對于這二者是否為同一疾病，在醫學界不斷有爭論，但始終無法作結論。從基因背景分析IgA腎病臨床表現產生的內因及其與紫癜性腎炎的關系，將有助于提高上述疾病的診治水平。根據反復發作性肉眼血尿IgA腎病患者及紫癜性腎炎患者的臨床表現特點，白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1ra）應該是一個很重要的候選基因。大量的體外、體內和臨床研究證明，白細胞介素-1（IL-1）在IgA腎病的發生以及肉眼血尿的發作中起重要作用，靜脈注射IL-1能在IgA腎病模型動物誘發血尿的發作。此外，IL-1作為一個重要的炎癥因子，能夠通過自分泌或旁分泌的形式刺激腎小球系膜細胞增生和細胞外基質的產生，并且與腎小球新月體的形成、自身免疫性疾病患者的血管炎及皮膚損害的發生有關。IL-1ra能夠競爭性地與IL-1受體結合，從而抑制IL-1的作用。因此，體內IL-1活性在很大程度上取決于IL-1ra對其的調控。IL-1ra基因第2號內含子中存在數目可變串聯重復（VNTR）多態性，其重復序列長86bp，在人群不同個體中，該重復序列出現的次數從2次到6次不等。由于在IL-1ra基因這段重復序列中含有三個蛋白結合位點，這種結構特點提示該基因多態性對其編碼蛋白質的產生有可能造成影響。通過對不同臨床類型IgA腎病患者IL-1ra基因多態性進行分析，我們發現，IgA腎病群體其IL-1ra基因多態性的分布與正常人群相比并無明顯差異，但若按IgA腎病的臨床亞型分別加以比較，則發現表現為反復發作性肉眼血尿的IgA腎病患者，其IL-1ra基因IL-1RN*2等位基因的攜帶率明顯高于正常人群，而且也比其它類型IgA腎病患者高。上述結果提示，反復發作性肉眼血尿型IgA腎病與其它類型IgA腎病在臨床表現上的差異與患者的基因背景有關。根據這一線索，我們又對紫癜性腎炎患者IL-1ra基因多態性的分布進行了觀察，發現紫癜性腎炎患者IL-1ra基因IL1RN*2等位基因的攜帶率明顯高于正常人群，而與反復發作性肉眼血尿IgA腎病非常相似，結合上述兩組患者在疾病的發病年齡、誘發因素、小血管病變以及遺傳背景上的諸多相似性，我們由此得出結論：反復發作性肉眼血尿型IgA腎病實質上是紫癜性腎炎的一個亞臨床表型，其在IL-1ra基因多態性上與紫癜性腎炎的相同表現形式有可能是二者之間的共同點。為了進一步揭示IL-1ra基因型與其表型之間聯系的本質，我們對不同基因型IgA腎病和紫癜性腎炎患者外周血單核細胞在炎癥因子刺激下IL-1ra的產生能力進行了研究，發現攜帶IL-1ra基因IL1RN*2等位基因者，其單核細胞在GM-CSF刺激后，IL-1ra的產生能力明顯低于與之相配對的不攜帶該等位基因者。而攜帶與不攜帶IL1RN*2等位基因個體其單核細胞IL-1的產生能力并沒有明顯差異。證實了攜帶IL1RN*2等位基因者其體內IL-1ra的產生能力存在缺陷，這類個體在炎癥情況下，體內IL-1的活性可能較不攜帶IL1RN*2等位基因者強。通過剖解不同臨床亞型IgA腎病IL-1ra基因型的分布，不僅對反復發作性肉眼血尿IgA腎病和紫癜性腎炎的發病機制提出了新的觀點，也為臨床上嘗試在上述患者中，根據IL-1ra基因型有針對性地選擇IL-1ra進行干預治療奠定了基礎。
8 倡導疾病基因多態性研究的新觀點
過去10年來，國際上有關疾病基因多態性的研究論文大量涌現。論文涉及臨床醫學各個領域，特別在心血管疾病、腦血管疾病、糖尿病、腎臟病、腫瘤、自身免疫病等范圍做了大量工作，取得了不少成績，但其重要意義及未來發展前景并未獲得廣大臨床工作者的共識。從事此項工作者大都是從遺傳學或分子遺傳學的角度切入，研究工作的重點往往局限于基因多態性與疾病發生相關性，強調基因多態性與疾病易感性的關系，或是簡單地了解基因多態性與疾病預后、轉歸的聯系，忽視了疾病基因多態性（gene polymorphism）與臨床表型多樣性（phenotype polymorphism）的內在聯系，沒有把研究重點放在為什么不同的個體在相同的疾病會表現不同以及為什么不同的個體對相同的治療藥物會有不同的反應等的原因上。當然，要回答這些問題遠比簡單地了解某種基因多態性與疾病易感性的關聯要復雜得多。它不僅需要有分子遺傳學的知識，還要有深厚的臨床醫學基礎。在熟知某一種臨床疾病其表型多樣化的基礎上，需要精確地分析其病理生理上的特點，選擇合適的候選基因，進一步調查不同基因多態性與不同臨床表型之間的內在聯系。在得到初步線索后，還要進一步從基因多態性所帶來的該基因功能上的差異加以論證。只有確定能對疾病的病理生理狀態施加影響，才可建立此種基因多態性與不同臨床表型之間的聯系。因此，疾病基因多態性的研究不僅需要有精密的分子生物學技術，更重要的是要有深入的臨床分析及縝密的思考探索，才能揭開疾病本質的真實面目。目前國外不少研究者對同一種疾病（如心血管疾病）及同一種候選基因（如ACE）進行的基因多態性分析，結論可以完全不同，其根源都在于未能深入探索，抓住疾病多樣表型的本質，即使做了不少工作，仍未能觸及實質問題。
這類研究往往將某一個疾病患者作為群體與正常人群進行比較，滿足于基因多態性是否與“疾病易感性”有關的觀察，未深入到臨床表型與基因多態性的聯系；其次，他們也普遍地忽視了基因多態性與其功能之間聯系的研究。
歸納過去這些年來在一系列腎臟疾病基因多態性方面的研究工作，我們總結出以下幾點作為臨床進行基因多態性研究的基本觀點：
8．1 候選基因的選擇要有明確的病理生理學基礎。研究某種疾病基因多態性與其發病及臨床表型的聯系，所選擇候選基因的基因產物在該病發病機制中所起的作用應該得到肯定，如上述GLUT1基因多態性與糖尿病腎病的研究和IL－1ra基因多態性與IgA腎病的研究等。
8．2 候選基因多態性對其所編碼的蛋白質具有功能影響。一個基因序列中往往有多個多態性位點，但并不是所有的多態性位點都會對該基因所編碼的蛋白質產生影響，也不是所有對基因產物有影響的多態性位點都位于基因的編碼區。應該選擇那些能對其編碼蛋白質的產生有影響的基因多態性位點（perverse polymorphism）進行研究，使這類研究得到深化，并為特異性干預治療奠定基礎。
8．3 不同基因型的分布與相應臨床表型之間有一定的聯系。以往基因多態性研究常局限于將某一疾病患者做為一個群體與正常人進行比較，根據候選基因不同等位基因在上述兩個人群中的分布特點來判斷其在疾病發生中的作用。這種研究模型是不完全的。應該在上述研究的基礎上，進一步分析不同基因型在同一類疾病不同亞臨床表型者之間的差異，進而闡明疾病臨床表型多樣性的本質，為臨床個體化治療提供依據。如上述IL-1ra基因多態性在不同臨床類型IgA腎病患者中的分布，IL-Lra基因多態性基因型的分布在IgA腎病和正常人之間并無明顯差異，但是，在IgA腎病患者中表現為反復發作性肉眼血尿者，IL-1ra基因IL1RN*2等位基因的攜帶率明顯高于其它臨床類型IgA腎病患者，而且也比正常人高。進一步研究證實了攜帶IL1RN*2等位基因者體內存在IL-1ra產生的缺陷。
8．4 由于研究對象是多基因病，應根據疾病病理生理學改變，選擇多個候選基因客觀地從不同的側面進行分析，做到逐一剖解，整體分析，既搞清某一基因多態性的作用，也要對不同候選基因之間的相互作用進行分析。
8．5 所觀察的亞臨床表型定義明確，如糖尿病腎病、反復發作性肉眼血尿等，以避免擬表型（phenocopy，一種環境條件引起的表型與某一特定基因所產生的表型相似）的干擾。另外，研究的樣本量要足夠大，具有充分的代表性。
8．6 疾病基因多態性的研究最好是由從事基礎與臨床的研究者進行跨學科的合作，才能事半功倍。
9 發展更具個體（個性）化的臨床醫學
疾病基因多態性研究既然揭示了同一種疾病不同臨床表型的實質，也就為更具個體化的治療打下了基礎。例如ACE基因呈DD型者其血漿中ACE活力高，促使病情惡化，應用ACEI的指征強烈。這就使臨床治療能達到個體化的目的，而不是對同一病種患者泛泛地應用ACEI。換而言之，臨床醫學將更符合個體化的要求。
在基因多態性研究的引導下，臨床醫師將有可能預斷不同的個體在同樣的致病條件下會出現什么樣的病理反應和臨床表現，也就是不同的臨床表型（clinical phenotype），不論在疾病的預防和治療上都能采取更具個體化的措施。高血壓病的治療將根據基因多態性的研究選擇更有針對性的藥物，調整其劑量，而不是泛泛地使用ACEI、鈣拮抗劑或交感神經受體阻斷劑。合并癥的防治也會更具個性，例如哪些患者應著重防治腦血管合并癥，哪些患者應重點防治心血管合并癥。
總之，不論治療和預防工作都會朝著個體化發展，更具針對性。
疾病基因多態性的研究，使我們在認識疾病的思維方法上有了一個重大的突破。過去兩個世紀以來，現代醫學在認識疾病的規律上基本上遵循著下列模式：致病因子（外因）的作用特點、性質→機體的反應、表達→器官和組織的損傷、結局。這種三點論的模式在以外因為主導的疾病研究中，特別是針對感染性疾病常常是成功的。例如瘧疾、血吸蟲病、細菌性痢疾等等。當致病因子的作用特點得到詳盡闡明后，其余的問題也就迎刃而解。然而在各種多基因病，內因起著更為重要的作用，上述的研究模式常常不能取得成功。例如前面所提到的IgA腎病，過去30年來，國際上數以千計的論文反復研究沉積在腎組織中IgA的來源、性質、致病作用，但始終未能揭開IgA腎病的發病機制及預防治療措施。我們通過基因多態性研究，對于一部分病例（反復發作性肉眼血尿）的發病機制及治療已初見端倪。糖尿病腎病的研究也反映了同樣的規律，高血糖的致病作用固然是很重要，但特定基因在機體（不同組織器官）的反應及表達同樣具有重要意義，甚或更具決定性作用。而后一因素（內因）在很大程度上是與基因多態性密切相連的。看來，今后在認識疾病的思維方法上，特別是對多基因疾病，應該更強調對內因的研究，多了解機體（器官、組織）對外來刺激（致病因子）反應上的差異性，毫無疑問，基因多態性在這方面將起著重要的作用。