淺談RTPCR實驗方法中常見污染問題及對策

李軻反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）是一種體外核酸擴增技術，它具有特異、敏感、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點，能在幾個小時內完成從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的目的產物供分析研究和檢測鑒定，所以近年來RT-PCR技術被廣泛應用于人和動物的多種傳染病早期診斷。

筆者一直從事實驗室動物疫病檢測工作，現就應用RT-PCR實驗方法過程中出現的一些常見污染問題做如下論述，僅共同行參考和探討。 RT-PCR實驗有三步：提取RNA、反轉錄（RT）、PCR擴增及擴增產物分析，在這一過程中，zui令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性。

污染原因主要有以下幾個方面： 

1、樣品間的交叉污染收集樣品的容器zui好使用一次性的，如重復使用，應在使用前應于180℃的高溫下干烤6小時或更長時間；樣品存放時要密封嚴實，以防外溢造成相互間的交叉污染；樣品在提取過程中離心管及吸樣槍頭zui好使用一次性的，以免不同實驗樣品間相互污染；由于吸樣槍污染會導致樣品間的污染，也是一個值得注意的問題，由于操作不慎將樣品或提取物吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取時要十分小心，吸時要慢，吸取盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染；同時要注意操作時不要劇烈地搖動反應管，開蓋時也容易造成氣溶膠污染。若產生氣溶膠較多，會造成環境污染，不僅會導致實驗失敗，而且也會損害操作人員身體健康，因此每次實驗完畢都要及時清理實驗臺面，用0.5%次氯酸鈉消毒后再打開紫外燈照射半小時。 

2、RT-PCR本身使用的試劑污染在試劑配制過程中，由于加樣槍、容器及其它溶液被污染。因此所有試劑都應盡量小量分裝，以減少重復加樣次數，避免污染機會，另外RT-PCR試劑應盡可能密封好分類存放。每次操作完畢后同樣要進行臺面消毒和紫外線照射消毒。 

3、擴增產物的污染這是實驗中zui常見的問題，極微量的擴增產物污染就可造成假陽性，每次實驗完后，擴增產物都要及時密封后處理。在做RT-PCR實驗時，一般都應設陽性對照，操作不慎，污染可能性很大，因而當某一RT-PCR試劑經自己使用穩定，檢驗人員經驗豐富心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照，或間隔性設陽性對照，以減少污染機會。 

4、操作人員污染只要存在少量的RNA酶就會引起RNA的降解，從而影響結果的準確性，RNA酶可存在操作人員手汗、唾液中，也可灰塵中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成實驗失敗，因此操作人員應戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換，。設置PCR操作專用實驗室，所用實驗用具應為專用，并合理分隔實驗室，將樣品的提取、配制RT-PCR反應液、PCR循環擴增等步驟分室進行，實驗前應將實驗室及實驗人員工作服用紫外線或臭氧消毒以破壞殘留的DNA或RNA。任一種科學的實驗方法都有其自身完善和發展的過程，RT-PCR方法也不例外，在檢測質量能保證的情況下，若能簡化樣品提取步驟或縮短其時間，減少擴增循環次數，都能對防止污染有利。

總之，RT-PCR不管從特異性方面還是從靈敏性方面講都具有難以匹敵的優勢，結果的可靠性和可信性應該是zui好的，是較具權威性的檢測方法，我們期待著它能盡快地自身完善和發展。