紫外分光光度法
測定靈芝孢子粉多糖含量的方案
實驗參與人員：
實驗進行的時間：
一、實驗目的
建立靈芝孢子粉多糖的含量測定的方法。
二、 操作步驟
1. 對照品溶液的配制：
取無水葡萄糖約10mg，精密稱定，置于10ml容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，加甲醇定容，制得對照品貯備溶液。
2.測定波長的選擇：
加顯色劑的空白溶液：精密稱取苯酚約0.5g，用100ml蒸餾水定容。
對照品溶液：密量取對照品溶液0.5ml于10ml刻度試管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml濃硫酸，加蒸餾水至刻度，振搖5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min即的。
測定：在可見光區200-700nm內對三份溶液進行掃描，確定顯色劑是否影響吸光度，確定對照品溶液的最大吸收波長。
照紫外-可見分光光度法（2010版藥典附錄V A ）測定,待測定對照品溶液的吸收光譜中顯示，無水葡萄糖在與苯酚、濃硫酸顯色后，在480-510nm處有明顯紫外吸收，λmax=492nm，故確定測定紫外吸收的測定波長為492nm。
3. 供試品溶液的制備方法考察
取靈芝孢子粉粉末（過四號篩）0.5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加水90ml，加入回流3h，放冷，搖勻，精密量取50ml，加入乙醇150ml，搖勻，4℃放置12h，取出，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解并轉移至150ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，為供試品溶液。
4. 標準曲線的繪制
精密吸取對照品溶液0.10ml，0.15ml，0.20ml，0.25ml，0.3ml分別置于試管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml濃硫酸，加蒸餾水至刻度，振搖5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸餾水為空白對照，在最大吸收波長處測定各溶液吸光度。以對照品質量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。
5. 方法學考察
5.1精密度試驗
取標準曲線項下1.5mL無水葡萄糖對照品溶液制備的樣品，在最大吸收波長處連續測定吸光度6次，求出RSD。
5.2穩定性試驗
取藥材0.5g，精密稱定，按供試品制備方法制備溶液，精密量取該供試品溶液0.5ml，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml濃硫酸，加蒸餾水至刻度，振搖5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，在反應后10min，15min，25min，35min，45min，60min，在最大吸收波長下測定吸光度,求RSD值。
5.3重復性試驗
取一份藥材約0.5g，精密稱定，分別精密量取6份供試品溶液0.5ml，供試品制備方法制備溶液，在最大吸收波長下測定吸光度，按測定數據求出多糖含量，并求算平均含量和RSD。
5.4加樣回收率試驗
精密稱取同一批號的樣品約0.25g，共6份，分別精密加入對照品儲備液2.5ml，按照供試品制備方法制備溶液，照標準曲線制備項下的方法，依法顯色，測定吸光度，按測定數據求出各自的多糖含量，并得到回收率及RSD。
樣品溶液的制備 取靈芝孢子粉粉末（過四號篩）0.5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加水90ml，加入回流3h，放冷，搖勻，精密量取50ml，加入乙醇150ml，搖勻，4℃放置12h，取出，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解并轉移至150ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，為供試品溶液。
測定 分別精密吸取0.5ml樣品溶液至試管中，加入1.0ml的5%苯酚溶液，迅速加入7.0ml濃硫酸，加蒸餾水至刻度，振搖5min，置沸水浴中30min，再冷水浴10min，以蒸餾水為空白對照，在最大吸收波長處測定吸光度，從標準曲線上讀出樣品溶液中含多糖的含量，計算其含量，即得。
