過氧化氫酶的活性測定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波長下有強烈吸收,過氧化氫酶能分解過氧化氫,使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間而降低.根據測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性.
【儀器與用具】
紫外分光光度計；離心機；研缽；250ml容量瓶1個；0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水浴；
【試劑】
0.2mol/L
pH7.8磷酸緩沖液（內含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L
H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標定）.
【方法】
1.酶液提取：稱取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中,加入2～3ml
4℃下預冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后,轉入25ml容量瓶中,并用緩沖液沖洗研缽數次,合并沖洗液,并定容到刻度.混合均勻將量瓶置5℃冰箱中靜置10min,取上部澄清液在4000rpm下離心15min,上清液即為過氧化氫酶粗提液.5℃下保存備用.
2.測定：取10ml試管3支,其中2支為樣品測定管,1支為空白管,按表40-2順序加入試劑.
表40-2
紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表
管
號
S1
S2
S3
粗酶液(ml)
0.2
0.2
0.2
pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5
蒸餾水(ml)
1.0
1.0
1.0
25℃預熱后,逐管加入0.3ml
0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即記時,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下測定吸光度,每隔1min讀數1次,共測4min,待3支管全部測定完后,按下式計算酶活性.
3.結果計算：
以1min內A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）.
過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=
式中
A240
=
AS0－
AS0—加入煮死酶液的對照管吸光值；
AS1,
AS2—樣品管吸光值；
Vt—粗酶提取液總體積（ml）；
V1—測定用粗酶液體積（ml）；
FW—樣品鮮重（g）；
0.1—A240每下降0.1為1個酶活單位（u）；
t—加過氧化氫到最后一次讀數時間（min）.