測序新技術速覽

454技術 樣品制備 

將基因組打成較短的DNA片段，再將片段與接頭相連，以便使其更容易與磁珠結合在一起（一個DNA片段結合于一個磁珠）。將PCR產物包被于“油包水”的乳化劑中，每一滴乳化劑內除PCR產物外，還含有一個結合了一個DNA片段的磁珠，這樣，PCR擴增過程就可以在每一滴乳化劑內獨立進行，而沒有其它競爭性或者污染性序列的影響。如此，使整個DNA片段進行平行擴增。擴增反應完成后，每個磁珠上的DNA片段擁有了成千上萬個相同的拷貝。經過富集以后，這些片段仍然和磁珠結合在一起，隨后就可以放入到PicoTiterPlate板（一種光纖載板）的樣品孔內供后繼測序使用了。

焦磷酸測序（Pyrosequencing）

在光纖PicoTiterPlate板樣品孔內還有測序過程所需的酶類及引物（引物與DNA片段末端的接頭序列互補），當未經熒光標記的核苷酸流經過樣品孔時，每次只允許一個互補dNTP接入，進行互補新鏈的合成。每當一個核苷酸連接到新鏈上時，就會釋放一分子的焦磷酸鹽（PPi），而后PPi與相應底物反應形成1分子ATP，ATP再驅動熒光素酶轉變為氧化熒光素酶，而氧化熒光素酶可以發出可見光，可被檢測儀器捕獲，形成峰圖。該技術的序列閱讀長度介于100到150個核苷酸之間。（具體原理見文后擴展閱讀）

Solexa測序技術  樣品制備

將基因組DNA打成幾百個堿基（或更短）的小片斷，在片斷的兩個末端加上接頭，利用ZL的芯片:其芯片表面連接有一層單鏈引物，DNA片斷成單鏈后通過芯片表面的引物堿基互補被一端“固定”在芯片上，引物擴增使得單鏈DNA成為雙鏈，該雙鏈變性后成為單鏈，其一端“固定”在芯片上，另外一端（5'或3'）隨機和附近的另外一個引物互補，被“固定”住，形成“橋”。這樣的反應在上千萬DNA單分子上發生，形成的單鏈橋以周圍的引物為擴增引物，在芯片表面進行擴增，形成雙鏈。雙鏈經變性成單鏈，再次形成橋，成為下一輪擴增的模板繼續擴增，經過30輪擴增，每個單分子得到了1000倍擴增，成為單克隆“DNA簇群”。“DNA簇群”在Genome Analyzer 綜合分析儀上進行序列分析 。
 

采用“可逆性末端終止反應”進行序列分析(圖片來源：Katie Ris-Vicari)

序列合成反應體系包括有引物、DNA聚合酶、4種標記了不同熒光的核苷酸，每個核苷酸的堿基被保護基團封閉。每次反應摻入一個核苷酸，該核苷酸類別可通過標記熒光進行識別，經過掃描，讀取該次反應顏色后，位于堿基3'末端的保護基團被除去，繼續下一輪反應，如此反復，得出片段的精確序列。該技術讀長為30–35個核苷酸。

SOLiD技術 樣品制備 

DNA經物理方法處理成幾百堿基左右的片段，兩端與接頭相連接，與Adaptor相連的DNA片段和固定有與接頭序列互補序列的磁珠混合后，進行Emulsion PCR。PCR擴增結束后，將變性DNA單鏈與磁珠移至載玻片上。

連接法測序

測序引物與接頭可以互補雜交，其5’端可與和鄰近序列互補的寡核苷酸相連。八聚體寡核苷酸可競爭性與引物相連接（該寡聚體的第四位和第五位為熒光標記位點）。當其標記顏色被讀取后，即將連接上的寡核苷酸在第五位和第六位之間切斷，以移除標記，進行下一輪反應，依此循環。在第一輪反應中，可以得到確定的堿基位點為：4、5、9、10、14、15位堿基等。重復該反應過程，偏移一位堿基，使用較第一輪少一個堿基的引物進行反應，可以確定的堿基位點包括：3、4、8、9、13、14等，如此往復，直至偏移至引物的第一個堿基（即待測序列0位點堿基）。由于該位點堿基已知，可通過讀取的熒光顏色得知位點1的堿基類型，然后，又以位點1堿基熒光顏色推知位點2的堿基類型，依此類推，直至整個序列讀序完成。此技術目前的讀長為30至35個堿基。