浙江大學用戶發表文章采用MassWorks對轉化產物進行了確證

　　繼甘肅省出入境檢驗檢疫局技術中心周圍主任等，利用MassWorks質譜校正技術在Rapid Commun. Mass Spectrom(2011, 25, 3097–3102)發表高水平外文文章后，浙江大學瞿海斌教授在Industrial & Engineering Chemistry Research(美國)上發表英文文章《Application of Multivariate Curve Resolution Method in the Quantitative Monitoring Transformation of Salvianolic Acid A Using Online UV Spectroscopy and Mass Spectroscopy》，采用MassWorks在單四極桿質譜上測定了丹酚酸A兩種轉化產物的精確質量數，并利用譜圖準確度實現了對這兩種產物分子式的準確識別。

多元曲線分辨法在在線紫外光譜和質譜定量檢測丹酚酸A轉化中的應用

Xintian Zheng，Xingchu Gong，Qin Li，Haibin Qu

(浙江大學藥物信息研究所)

摘要：本文應用在線紫外光譜檢測分析系統對丹酚酸A(SAA)的轉化過程進行了探索性研究。一種基于多元曲線分辨的化學計量學方法應用于解決反應物濃度和譜圖分布問題從而評價動力學分布。為研究溫度和pH兩個因素對SAA轉化過程的影響，動力學測試將溫度設定在25-90℃，pH值設定在2.5-10范圍內。SAA轉化過程中首先發生降解反應，當溫度升高時，SAA的降解速度加快。當pH值高于7時，SAA轉化速度加快，當pH值小于6.5時則可保持穩定。用MassWorks軟件結合單四極質譜測定了SAA的兩種轉化產物的精確質量數，并借助譜圖準確度實現了對這兩種轉化產物的確證。結果表明，在中藥制劑生產過程中，作為主要生物活性物質的SAA不應在高溫和高pH值條件下生產。

1 前言

　　丹酚酸A(SAA)是丹參的主要有效成分，具有多種藥理活性，包括抗血小板、抗肝纖維素化、消炎、抗癌等特性1。SAA的這些功能據推測源于其強大的抗氧化性2-7。因此，SAA作為一種新的待開發藥物在制藥領域受到廣泛的青睞。作為咖啡酸和丹參素的三聚體，SAA在水溶液中和丹參的某些制備過程中是不穩定的8。在整個加工過程中加熱或強酸強堿都可能導致SAA的轉化。無疑，SAA的穩定性將會影響SAA制備藥物的功效和安全性。

　　至今，對中藥材不穩定生物活性物質的轉化或降解的研究較少9-11。而且這些研究都是應用離線檢測方法。這些離線檢測方法通常費時費力，當轉化很慢時可適用。然而，當轉化速度較快時，水解、氧化和沉淀等副反應在離線樣品測定過程中可能同時發生。因此，需要一種實用、快速且無損的在線監測方法，如連續流動系統。這種在線監測具有重現性好、過程自動化、樣品和試劑消耗低等優點。同時還可對降解過程進行動力學研究12。

　　本文采用在線紫外光譜檢測方法監測了SAA的轉化過程。多元曲線分辨法可用于解決吸收分布、反應物光譜提取和輔助定量等問題。結果用于動力學模型而得到速率常數。MassWorks軟件結合單四極質譜分析提供了有關轉化產物可能標示的確證信息。

2 材料和方法

2.1 試劑和藥品：純度大于95%的SAA及其轉化產物通過HPLC分析，在本實驗室得到分離純化。色譜級乙腈和甲酸分別購自Merck(Darmstadt，德國)和Tedia(Fairfield，OH，USA)。高純水通過Millipore Milli-Q系統(Milford，MA,USA)制備。其他化學物質均為分析純。

2.2 儀器條件：T6紫外分光光度計(Pukinje,Beijing,China)帶win5軟件(Pukinje,Beijing,China)，用于光譜采集，設置如下：掃描范圍220-400nm，數據間隔1nm，中等掃描速度，5mm石英流通池通路。

　　連續流路由K501泵(Lumtech Analytical，Germany)、一個水浴反應器，一個流通池和一個蠕動泵管(200cm*2mm ID)組成。過程中，泵以20ml/min的流速連續提供樣品，樣品溶液在9s內到達檢測器流通池。在線紫外分光光度分析系統示意圖如圖1所示。

圖1 在線紫外分光光度法分析系統示意圖，P為二元泵，流速20ml/min.T為溫度控制系統.PC為光譜采集的工作站.水浴設置不同的溫度如表1所示。

　　安捷倫單四極桿質譜(Agilent, IL,USA)帶ESI接口用于質譜檢測分析。所有樣品通過過濾器直接注入質譜分析而不過柱子分離。流動相為0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)。流速為0.5ml/min。高純氮用作干燥氣。電噴霧負離子模式監測參數設置如下：毛細管溫度350℃，毛細管電壓3500V，干燥氣流速10ml/min，霧化氣電壓40psi。全掃質譜分析，譜圖掃描在100-800m/z范圍內。掃描數據以完整模式存儲用于MassWorks(Cerno Bioscience)分析。同時，離子閾值設為0，采集速率為0.05。

2.3 步驟：略。

2.4 多元曲線分辨法：略。

2.5 反應產物的確證：不同的時間間隔，應用質譜法采集和分析每份20ul的樣品，來確定轉化產物。為得到穩定的信號，每個樣品掃描2min。得到的數據導入MassWorks軟件分析。SAA作為純標準用于內標校正。MassWorks軟件提供了轉化產物的計算的精確質量數和可能的分子式。

3. 結果和討論

3.1 SAA轉化中溫度和pH的影響：略。

3.2 MCR-ALS分析轉化實驗：略。

3.3 動力學計算：略。

3.4 SAA轉化過程的質譜分析：本實驗的MCR結合UV分析方法沒有排除反應最終產物為單組分的多種物質共存的情況。本實驗提到的反應中，同樣動力學分布得到的許多物質的分子式(例如，兩種物質具有相同的濃度分布和譜圖分布)能夠產生所謂的譜圖矩陣秩脫。所以，許多物質被認為是許多不同分子結構的混合物，而不是單一分子結構的純凈物。

　　反應系統中化學物通過質譜檢測和MassWorks軟件的進一步證實進行確證。MassWorks軟件能夠提供這些轉化產物的精確質量數。采用包括質荷比和峰形的全面校正得到較高的譜圖準確度，達到更準確的組分檢測34。轉化產物的準分子離子峰為509和491。結果列于表2和表3，說明在反應系統中產生兩種轉化產物C26H21O11和C26H19O10。結果與我們之前研究的SAA(C26H22O10,[M-H]- M/Z=493)90℃下在水溶液中被氧化，反應產物包括丹酚酸C(C26H20O10，[M-H]- M/Z=491)異丹酚酸C(C26H20O10, [M-H]- m/z=491)和兩種新的多酚酸(C26H22O11，[M-H]- M/Z=509)35的結果相同。這些轉化產物的標準質譜圖如圖7所示，基于MCR得到這些產物的質譜。4種氧化產物相似的紫外光譜圖如圖8。MCR-ALS軟模式分離和鑒定的的每個物質的光譜圖說明其有著本質的區別。相反，MCR結合紫外光譜方法是一種有效的方法，不需要分離，因此，其在在線化學過程監測中是一種很有用的方法。

表2 MassWorks軟件分析的SAA轉化產物分子離子[M-H]-m/z=491^a的結果

^a表示主要基于譜圖準確度得到的前十個可能結果的排序，^bRMSE為根均方誤差，^cDBE為雙鍵當量

表3 MassWorks軟件分析的SAA轉化產物分子離子[M-H]-m/z=509^a的結果

^a表示主要基于譜圖準確度得到的前十個可能結果的排序，^bRMSE為根均方誤差，^cDBE為雙鍵當量

4. 結論

　　略。

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