第六步：恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準確地控制工作環境溫度，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間，檢測器的恒溫要求則更高。
溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有影響。一般來說，溫度升高，可提高溶質在流動相中的溶解度，從而降低其分配系數K，但對分離選擇性影響不大;還可使流動相的粘度降低，從而改善傳質過程并降低柱壓。但溫度太高易使流動相產生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對保留時間、相對保留時間都有影響。在凝膠色譜中使用軟填料時溫度會引起填料結構的變化，對分離有影響;但如使用硬質填料則影響不大。
總的說來，在液固吸附色譜法和化學鍵合相色譜法中，溫度對分離的影響并不顯著，通常實驗在室溫下進行操作。在液固色譜中有時將極性物質(如緩沖劑)加入流動相中以調節其分配系數，這時溫度對保留值的影響很大。
不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5℃時，就會造成基線漂移起伏。示差折光檢測器的靈敏度和最小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內。
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