液相色譜柱的選擇

1.HPLC色譜分離模式的選擇

在建立化合物的HPLC方法時，可以首先根據化合物的分子量大小，極性大小及PKa，選擇合適的分離模式，在適當的分離模式下去再去優化同類的色譜柱及流動相。化合物分子量<2000Da時，可根據圖1來選擇：

圖1 分子量<2000Da的分離模式

化合物分子量>2000Da時，可按圖2來選擇

圖2分子量>2000Da的分離模式

2.反相鍵合相色譜柱性能影響因素

對于大部分小分子化合物來說都可以選擇鍵合相的反相色譜，下面先分析反相鍵合相色譜柱性能的影響因素，只有了解影響色譜柱性能的因素，才能結合目標分析物的性質、需要達到的分析效果及實驗室條件來選擇適合的色譜柱。

2.1 影響色譜柱性能的物理參數：

⑴硅膠純度

硅膠純度和殘留金屬離子濃度，硅膠的雜質會影響化合物的峰形，硅膠表面的金屬含量高會影響堿性化合物的峰形，發生拖尾。

⑵色譜柱尺寸

填料床的長度和內徑，增加色譜柱長度，可以提高分辨率；寬柱徑，提高載樣量。

⑶顆粒形狀及粒徑

球型或不規則形，球形顆粒柱效高、重現性好、柱床結構均勻，不規則形柱床結構不均勻、流動相線速度不均勻，容易譜帶展寬；平均顆粒直徑，粒徑越小，柱效越高，柱壓也越高。粒徑分布越廣則柱效越低。

⑷顆粒表面積

顆粒外表面和內部孔表面的總和，以m²/g表示，相對而言高表面積對樣品具有較強的保留能力，更大的柱容量和分離度。而低表面積能更快達到平衡狀態，更適合梯度洗脫程序。

⑸孔徑

顆粒的孔或腔的平均尺寸，范圍是80~300?，大孔徑的填料顆粒可以延長大分子溶質在填料表面的滯留時間，改善分離，所以大孔徑填料適合分離大分子化合物或者水動力體積較大的分子。

2.2 影響色譜柱性能的化學因素

⑴鍵合類型及鍵合相

鍵合相分子與基體單點相連為單體鍵合，這種鍵合方式可以提高傳質速率，縮短柱平衡時間，聚合體鍵合為鍵合相分子與基體多點相連，這種建和方式可以增加色譜柱穩定性，增加載樣量；鍵合相不同會直接影響化合物的保留行為。

⑵碳覆蓋率

高碳覆蓋率可以提高分辨率和重現性，但分析時間長。

圖 3高低碳覆蓋率

⑶封端

硅膠鍵合相填料中有部分未封端的殘留硅羥基，如圖封端可以減輕待測組分與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應，改善保留和峰形，這對于堿性化合物尤其重要。

圖4 硅膠鍵合相填料

3.反相鍵合相色譜柱的選擇

3.1 重現國標文獻中方法

選擇色譜柱粒徑、比表面積、基質表面特性、鍵合類型等相似的色譜柱，或者利用USP網站及一些色譜柱選擇軟件，如“column selector for acd/chemsketch”來查詢相似系數。選擇相似系數高的色譜柱。 

3.2 建立新化合物分離分析方法的色譜柱選擇

根據目標分析物的分子量大小、溶解性、Pka值，以及分離要求、儀器、成本等各方面來選擇色譜柱。

⑴粒徑（1.7μm、3μm、5μm等），根據分析時間要求（粒徑小，分析速度快）、靈敏度、儀器（粒徑越小，壓力越高）、價格等來選擇

⑵比表面積，高比表面積有助于分離，低比表面積更適合梯度洗脫程序

⑶孔徑，大分子化合物適合大孔徑，在保證比表面積的前提下，選擇孔徑大的。

⑷鍵合相的選擇

下圖是常見的化學鍵合相及其運用范圍。

圖5 化學鍵合相的類型及其應用范圍