表 5. 單糖的化學組成和分子量
表 6. 用于計算表 4 和表 5 分子量的元素的單同位素原子量和平均原子量
最初的計算是根據發表在 DrugBank 數據庫【2】的序列進行的，然而計算結果與我們實驗測得的質量數并不匹配。通過將 DrugBank 中的序列與之前文獻發表過的序列【3】進行比對，發現位于重鏈保守區域 219 位上的一個氨基酸不同，是丙氨酸而不是纈氨酸。 使用219 位為丙氨酸的序列的計算結果可以與完整蛋白質量數測定的結果以及先前報道的結果完全吻合【4】。為了進一步確認這點，我們進行了一系列的補充實驗。
將抗體還原后（無烷基化），采用設置不同分辨率的方法分析已分離的輕鏈和重鏈，來觀察在此分子量下能否實現同位素解析。由于輕鏈分子量較小，有可能得到同位素解析譜圖，而重鏈無法得到，因為重鏈質量是輕鏈質量的兩倍。若要采用不同的分辨率設置，方法設置分為兩個階段（從 0-15.8 min 分辨率設為 140 K，從 15.8-30min 分辨率設為 17.5 K）。通過優化梯度，實現輕鏈和重鏈的色譜峰完全分離。
在這項研究中，我們評價了兩種整體柱（PepSwift 250 mm×0.2 mm 內徑和ProSwift RP-10R 50 mm×0.1 mm 內徑），輕鏈和重鏈兩峰分離的保留時間之差均可大于 2 min（圖 6）。分別對輕鏈和重鏈的質譜圖（圖 6b 和 6c）去卷積。輕鏈的同位素解析質譜圖用 Xtract 算法去卷積，得到了單一同位素分子量23,025.3758 Da，與計算分子量只差 2.5 ppm。重鏈用 ReSpect 算法去卷積，產生三個峰，每一個峰代表一種主要的糖型，G0F，G1F 和 G2F（圖 7）。
圖 6. 還原型利妥昔抗體的色譜圖（A），輕鏈的一級全掃描質譜圖（B）和重鏈的一級全掃描質譜圖（C）。
C 中的插圖顯示的是電荷態 z=+25 的放大圖，三個峰代表三種不同的糖型。
圖 7. 輕鏈和重鏈的去卷積結果。在分辨率 140,000 全掃描模式下獲得輕鏈的質譜圖，通過 Xtract 算法去卷積，得到準確的單同位素分子量和完整的同位素分布圖（左圖）。在 17,500 的分辨率下測得重鏈的質譜圖，通過 ReSpect 算法去卷積，得到了平均分子量（右圖）。