2. HAT選擇雜交瘤
一般在融合24 小時后，加HAT選擇培養液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1 ml加入50 ml20 ％小牛血清完全培養液中。
因為在培養板內已加入飼養細胞、融合后的細胞，200 μl/孔。所以在加選擇培養液時應加3倍量的HAT。我們認為，融合后最初補加的量可用全量的2/3進行選擇，可得到滿意的篩選結果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養液維持培養兩周后，改用HT培養液，再維持培養兩周，改用一般培養液。
三、抗體的檢測
篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養而獲得雜交細胞系中，僅少數能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。
檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有
1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白質）、細胞和病毒等McAb的檢測。
2. RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。
3. FACS（熒光激活細胞分類儀）用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。
4. IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。
上述方法均為一般實驗室的常規方法，故在此不介紹具體的實驗過程。
可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。
四、雜交瘤的克隆化和凍存
克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。
1. 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
（1）有限稀釋法的程序
①制備飼養細胞懸液（同融合前準備）
②陽性孔細胞的計數，并調細胞數在1～5×103 /ml
③取130 個細胞放入6.5 ml含飼養細胞完全培養液，即20 個細胞/ml，100 μl/孔加A、B、C三排為每孔2 個細胞。余下2.9 ml細胞懸液補加2.9 ml含飼養細胞的完全培養液，細胞數為10 個/ml，100 μl/孔加D、E、F三排，為每孔1 個細胞。余下2.2 ml細胞懸液補加2.2 ml含飼養細胞的完全培養液，細胞數5 個/ml，100 μl/孔，加G、H兩排，為每孔0.5 個細胞。
④培養4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養液200 μl/孔。
⑤第8～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。
注：初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養液中加HT。
（2）軟瓊脂法
①軟瓊脂的配制
含20 ％FCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640
1 ％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42 ℃預熱。
0.5 ％瓊脂：由1份1 ％瓊脂加1份含20 ％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42 ℃保溫。
②用上述0.5 ％瓊脂液（含有飼養細胞）15 ml傾注于直徑為9 cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
③按100 /ml，500 /ml或5000 /ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。
④1 ml 0.5 ％瓊脂液（42 ℃預熱）在室溫中分別與1 ml不同濃度的細胞懸液相混合。
⑤混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10 分鐘，使其凝固，孵育于37 ℃，5 ％CO2孵箱中。
⑥4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養細胞的24孔板中進行培養。
⑦檢測抗體，擴大培養，必要時再克隆化。
2. 雜交瘤細胞的凍存
及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。
雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。
細胞凍存液：
50％小牛血清
40％不完全培養液
10％DMSO（二甲亞砜）
凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0 ℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3 ℃，待降至-70 ℃可放入液氮中。或細胞管降至0 ℃ 后放-70 ℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。
五、單克隆抗體的大量生產
大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種
1. 體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液含量為10～60 μg/ml，如果大量生產，費用較高。
2. 體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。
（1）實體瘤法
對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107 /ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml， 共2～4點。待腫瘤達到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10 mg/ml。但采血量有限。
（2）腹水的制備
常規是先腹腔注射0.5 mlPristane（降植烷）或液體石臘于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10 ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20 mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉種小鼠腹腔則產生腹水快、量多。
六、單克隆抗體的鑒定
對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的。應對其做如下方面的鑒定
1. 抗體特異性的鑒定
除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如
（1）制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。
（2）制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。
2. McAb的Ig類與亞類的鑒定
一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時，已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3 ％），將有利于沉淀線的形成。
3. McAb中和活性的鑒定
用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。
4. McAb識別抗原表位的鑒定
用競爭結合試驗、測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。
5. McAb親和力的鑒定
用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親和力。