(6)淋球菌連接酶鏈反應(LCP)檢測方法
目前PCR檢測淋球菌的方法被廣泛地使用。其特異性,靈敏性不斷提高。同時另一種基因診斷技術——連接酶鏈反應(LCP)也以其高特異,高靈敏性被應用于淋球菌的檢測中。LCP 與PCR不同之處在于LCP 用四對引物,所用酶是連接酶。連接酶可以將兩條相鄰引物連接起來。連接起來的兩條引物可以作為另兩條引物的模板,后者在連接酶作用下連接,又可作為模板,如此進行30-40次循環。LCP所用的模板處理方法與PCR模板制備相等。LCP所用的探針除了可以設計在CPPB基因上,也可以設計在染色體基因序列上,例如opa-1基因。美國Abbott實驗室在opa-1基因的48bp長的區域內設計了4個LCP探針,由于opa-1基因在淋球菌的染色體中有11次重復。因此,該組LCP探針具有高靈敏性和特異性。LCP反應過程:將模板加入LCP反應液中,LCP反應液:20mmol/L Tris-HCl pH7.6;100 mmol/L KCl 10 mmol/L MgCl2;1 mmol/L EDTA;10 mmol/L NAD+;10 mmol/L DTT,有標記物的兩個相鄰探針各40fmol/L,未標記的探針各40fmol/L,15U耐熱連接酶,反應條件:97℃1s,55℃1s,62℃50s,其40循環。100μl反應產物加入酶標板微孔中,進行顯色反應,最后用酶標儀讀取光值。根據Buimer的實驗證明,LCP在檢測男性尿道棉拭子標本的靈敏度為100%,尿液標本為88.9%,女性宮頸棉拭子標本為95.4%。LCP方法的特異性高達100%,這一點明顯高于PCR的特異性,避免了假陽性的發生。
3、臨床基因診斷淋球菌的注意事項
目前臨床檢測淋球菌的基因診斷方法主要采用PCR方法,但是該方法在臨床檢測中應注意幾個問題。
(1)引物設計 除了以上所列的淋球菌PCR引物外,還可從在其它基因上設計,但是引物序列應具有特異性。因為細菌的染色體較大,許多基因序列并沒有搞清楚;同時細菌之間或近或遠有一定的同源性,而且細菌所含質粒序列間也存在同源性,因此設計引物一定要進行基因數據庫比較分析,同時進行特異性和靈敏性實驗,從中選擇引物進行臨床檢測。
(2)臨床標本處理 對臨床標本來講,PCR模板要求越純越好。這就要求在采集標本時要取到準確的位置,對于無癥狀患者要適當多采樣,以保證采集到病原體細菌。另外由于臨床標本成分比較復雜,有時簡單處理的標本PCR擴增效果并不理想,這可能是由于雜質過多造成的,需要進一步純化,如用酚一氯仿抽提法純化,結果將會好轉。這種純化方法比較麻煩,目前已有商品化的DNA純化試劑盒,可以較簡便地從臨床標本中提取高純度的DNA。
(3)PCR產物的檢測方法 不久以前臨床PCR檢測淋球菌幾乎都采用電泳的方法進行PCR產物的鑒定。該方法存在許多問題,如由于肉眼觀察的主觀性而造成假陽性和假陰性的結果。目前用雜交顯色法代替電泳法,提高了結果判斷的特異性和靈敏性。
總之,PCR方法與LCP方法比傳統的培養法在靈敏性和特異性上有了很大的提高,時間也大大縮短。隨著基因診斷技術的不斷改進。PCR方法與LCP方法在淋球菌的檢測將會成為常規的檢測方法。
(五)藥敏試驗:在培養陽性后進一步作藥敏試驗。用紙片擴散法做敏感試驗,或用瓊脂平皿稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC),用以指導選用抗生素。
(六)PPNG檢測:β-內酰胺酶,用紙片酸度定量法,使用Whatman I號濾紙菌株能使其顏色由藍變黃,陽性為PPNG,陰性為N-PPNG。