深部真菌感染實驗室檢驗方法的比較

張珩1   柳洋2

（1. 天津市大港醫院檢驗科   2. 德州市中心血站）

關鍵詞：1-3-β-D-葡聚糖,真菌感染，實驗室，檢驗方法

key words: 1-3-β-D- Glucan, Fungus infection, Laboratory,Testing method

 　　一、深部真菌感染的現狀及其定義及引起深部真菌感染的因素

 　　真菌與人類有著極為密切的關系，據統計自然界中真菌至少包括50，000種，但是與人類疾病密切相關的真菌種類僅幾十種[1]。近年來,真菌感染尤其是深部真菌感染率呈逐年上升趨勢[2]，深部真菌感染就是指由致病性真菌所引起的人體深部感染，如侵及到皮膚深層如內臟，如肺、粘膜、肌肉、腦、消化道等器官，危害性較大，已越來越嚴重地威脅著危重患者的健康與生命，成為住院患者感染及死亡的主要原因之一[3]。.據報道，在美國醫院內菌血癥／敗血癥病例中，真菌感染在血流感染常見致病菌中居第三或第四位，真菌感染可明顯增加病人死亡率和住院率[4]。.由于深部真菌感染的早期診斷困難，治療藥物有限，感染所致病死率仍高達40％[5].因此深部真菌的診斷尤其是快速診斷日益受到臨床的重視。深部真菌感染的危害已越來越突出。目前深部真菌感染已成為免疫功能低下患者發病和死亡的主要原因[6]。引起深部真菌常見的致病菌主有念珠菌、隱球菌、曲菌、毛霉菌及放線菌等[7]　我們知道，真菌在人體中,與細菌之間起著重要的微生態平衡作用。近年來,隨著抗生素、免疫抑制劑及皮質類固醇激素在臨床上廣泛應用,器官移植、導管插管等普遍開展,深部真菌感染率越來越高。誘發深部真菌感染的因素主要有以下幾個方面：1、慢性消耗性疾病，如惡性腫瘤、糖尿病和尿毒癥等，可使機體免疫功能和抵抗力降低。2、長期使用廣譜抗生素，敏感的細菌被抑制，消除了正常菌群中與真菌相拮抗的細菌，使真菌得以大量繁殖。3、腎上腺皮質激素破壞淋巴細胞，使抗體形成減少。 4、大劑量X線照射、抗腫瘤藥物和免疫抑制劑都能抑制骨髓，使中性粒細胞和巨噬細胞減少，機體的免疫功能和抵抗力降低。5、侵入性檢查和治療（如長時間靜脈插管，留置導尿管和大手術）可引起局部損傷，成為真菌侵入的門戶，在機體抵抗力低落時在體內繁殖致病。

 　　二、深部真菌感染的危害性及臨床預后

 據統計，近30年深部真菌感染的發病率增加了3-5倍，真菌感染為艾滋病的重要死亡原因之一[6]。據美國115家醫院真菌感染調查顯示2004年真菌感染率為1993年的近4.6倍[8]；在國內2003年北京協和醫院深部真菌感染發生率為20世紀90年代的3.6倍。[9]，

深部真菌感染病主要包括深部皮膚真菌病，燒傷真菌病，婦科真菌病、惡性血液病患者的真菌的感染，肺部的真菌感染，外科的真菌感染，老年性真菌病，免疫缺陷患者與真菌感染，消化系統的真菌感染，骨髓移植患者的真菌感染，AIDS與真菌感染等。大量的文獻報道表明，嚴重大面積燒傷患者，由于多次創傷和打擊，病程冗長，體質嚴重耗竭，機體抵抗力下降，往往引起深部真菌感染，從而出現嚴重后果。據報道，近年燒傷真菌檢出率有上升趨勢，燒傷病人真菌感染死亡率可達47.4%［10］。在醫院的ICU病房中，真菌的感染死亡率最高 [11 ,12] 。據吳鐵軍等報道[13]　在ICU病房中，肺部真菌感染后死亡率高達39%　上述結果表明真菌已經成為醫院感染的主要致病菌之一，是住院病人死亡的主要原因之一，因此要十分重視真菌感染的監測。深部真菌感染發病率高、病情進展快，死亡率高、治療費用昂貴、臨床診斷困難、容易產生耐藥等，傳統的診斷方法主要有培養、病理切片等方法。但培養耗時長、陽性率低、標本容易受到污染。如痰培養容易受到上呼吸道寄生真菌及空氣中的真菌的污染影響培養結果。組織病理很難被病人接受因而在臨床工作中開展比較困難。面對持續高燒、抗生素治療無效的病人，因缺乏快速的客觀的實驗室診斷依據，貽誤治療。很多醫生采用經驗性抗真菌治療，但由于缺少有力的實驗室證據、抗真菌藥物昂貴等病人家屬很難理解，容易激化醫患矛盾。目前急需一種能夠早期快速診斷深部真菌感染的方法。正是由于諸多的原因及深部真菌感染對患者造成的嚴重危害程度，對于真菌特別是深部真菌的快速檢驗愈來愈受到臨床醫生的重視。

 三、實驗室檢驗真菌的常見方法

 1、培養與鏡檢

真菌感染的實驗室監測主要有四種方法：直接鏡檢、微生物培養、血清學實驗和DNA探針。直接鏡檢患者痰、喉或氣管分泌物培養陽性率為10%到30%。當血培養顯示菌落或放散的分生孢子鏈時可以得出陽性得結果。只憑借培養檢驗真菌，至少75%的患者會漏診[14]。病理切片法加真菌培養可使真菌檢驗的陽性率增加[15]。

2、分子生物學檢測方法

隨著科學技術的不斷發展，現的診斷技術不斷涌現，近年來，用于檢則真菌的抗原、抗體及代謝產物的血清學檢查和真菌核酸檢測（PCR技術）已用于深部真菌感染的實驗室檢測，并已成為這一領域研究的熱點。在國外，用于檢測血中和支氣管灌洗液中的真菌DNA的PCR的標準已有制定。平板真菌引物針對高度保守多拷貝基因序列，如18s核糖體DNA；使用此引物的分析以及特異寡核苷酸探針的雜交可以檢測血中各種的真菌，敏感度達到1-10fg/mL（16，17）。最近出現的實時PCR可以使真菌數量快速擴增，污染減少[18]。,但同時我們還應看到PCR檢測真菌的不足，首先，對實驗室條件要求較高，應在P3級以上的實驗室中才能進行，其次，運行的成本高，使用分子生物學的儀器和試劑均很昂貴。第三，PCR方法學是缺少一致性，缺乏對比。基因芯片技術作為一門嶄新的技術，已經在許多檢測日得到應用，得到世人的矚目，但仍然存在著許多如技術成本昂貴、復雜、檢測靈敏度較低、重復性差、分析泛圍較狹窄等問題。

3．血清學檢測方法

反向免疫電泳、免疫熒光、補體結合實驗同放免一樣依賴于正常的宿主免疫功能，通常在免疫低下的患者檢驗效率減低。Dupont等人報道乳膠凝集實驗的特異性很高，但敏感性不好[19]。  Masahiro等人得出相似得結果，敏感性、特異性和陽性預測值分別為23%、98%和64%。其他檢測抗原的實驗（如酶聯免疫吸附實驗）可以提高敏感性，但假陽性率依然很高，約10到20%[20]。

4真菌標志物1-3-β-D-葡聚糖檢測

目前，快速檢測病原微生物的方法主要有以下五大類：1、 直接從臨床標本中檢查微生物抗原。(Direct detection of pathogen’s antigens or antibodies from patient’s body fluids.)應用單克隆抗體結合各種形式的放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、熒光免疫分析（FIA）、時間分辨熒光免疫分析（TrFIA）、化學發光免疫分析（CIA）、生物發光免疫分析（BIA）等，足以檢出臨床標本中痕量的（10-18-10-21）微生物抗原，免去細菌或病毒培養過程，直接完成微生物感染的快速診斷。二、 檢查某些細菌的專有酶進行快速鑒定。(Detection of specific enzymes of bacteria. ) 已發現某些具有特征性的酶，應用適當的底物可迅速完成細菌鑒。3、 快速檢測細菌生化反應的色原或熒光底物及成套鑒定系統。(Chromogenic or fluorescence substrates for rapid identification of bacteria.) 國外以API為代表的細菌生化反應的成套系統中沒，已用新型的色原或熒光底物代替傳統的糖類和氨基酸。此種底物系由色原（呈色）或熒光與糖類或氨基酸人工合成。此底物無色，經細菌的細胞內或細胞外酶的作用而釋放出色原（呈色）或熒光，其優點是特異性強，反應迅速，易于自動化檢測，明顯提高了細菌生化反應的準確性，實現了細菌生化反應革命性變化。4、 應用不同載體的快速凝集試劑檢查與鑒定微生物。(Rapid agglutination tests by coated carriers. ) 所用的載體有聚苯乙烯粒子（Latex），明膠粒子、炭末、含蛋白A 的金葡萄球菌、膠體金、膠體硒。5、快速檢測細菌、真菌的毒素或標志物。（Rapid detection of bacterial toxins　or  markers）自臨床標本中直接檢出細菌的毒素，常比細菌培養更可靠。大量的研究結果和實踐表明，在上述的五大類的方法中，最為特異、敏感、有效的方法為檢測細菌、真菌的毒素或標志物的方法。

葡聚糖廣泛存在于真菌細胞壁中，占其干燥重量的80%-90%。其中1-3-β-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，尤其在酵母樣真菌中其含量可更高，1→3-β-D-葡聚糖是真菌細胞壁的重要組成成分之一，當真菌進入人體血液或深部組織后，經中性粒細胞及吞噬細胞的吞噬、消化處理后，（1→3）-β-D-葡聚糖可從細胞壁釋放出來進入血液及其他體液（如尿液、腦脊液、胸腔積液、腹腔積液等）中，我們可以檢測到其中的（1→3）-β-D-葡聚糖水平異常升高[21]。在淺部真菌感染中（1→3）-β-D-葡聚糖未被釋放出來，故在體液中的量不增高。研究報道將（1→3）-β-D-葡聚糖用于念珠菌血癥的早期診斷明顯優于傳統的培養法和血清學診斷試驗[22，23]。有研究顯示（1→3）-β-D-葡聚糖在體內的變化與病程呈平行關系[24]，連續測定葡聚糖含量有益于預測抗真菌化療效果[6]。

20世紀90年代初發現，1-3-β-D-葡聚糖可特異性激活自鱟變形細胞溶解產物提取的G因子，從而旁路激活鱟試驗，此過程稱為G試驗。臨床上，由于深部真菌感染的嚴重程度常常與血漿多糖的升高水平一致，故可將G試驗應用于深部真菌感染的診斷（包括念珠菌感染和曲菌感染等）。　

 四、1→3-β-D-葡聚糖定量檢測的應用情況

 目前，國內的專門用于檢測真菌1→3-β-D-葡聚糖儀器是北京金山川科技發展有限生產的MB－80系列，該公司的針對國內外發的情況，結合國內臨床使用現狀，經過大量實驗研究及臨床對照，在國內率先開發和研制成功了操作簡便，單人次獨立使用的體液深部真菌1→3-β-D-葡聚糖動態快速檢測試劑盒。其產品已獲得國家食品藥品監督管理局的批準。

國外，日本和光公司的產品獲得FDA批準，同國外的同類產中相比，國內的產品具有性價比高、服務快捷的特點。

據統計到目前為止，全國共有160余家醫院、血站等單位使用北京金山川公司的產品，其中包括北京協和醫院、301醫院、北京友誼醫院和上海瑞金醫院。普遍反應該產品具有以下幾個特點：（1）快速：1小時內即可完成檢測。微生物檢測屬于醫院常規檢測，傳統采用培養法，此方法準確低，時間長，一般需一周左右才能出結果，由于病人大量使用抗生素，常常造成檢驗結果的不準確。（2）定量：可定量檢測待檢測物中的真菌1→3-β-D-葡聚糖。定量的結果觀察病人的發病程度合理用藥十分必要。（3）動態：可動態檢測。（4）靈敏：真菌1→3-β-D-葡聚糖的最低檢測下限是1pg/ml，完全滿足用戶的需求。（5）準確：檢測病人不受用藥的影響，使以往在檢測過程中常常出現的假陽性和假陰性的大大降低。（6）操作簡便。本儀器具有操作步驟少的特點。只要對操作進行簡單培訓，操作者在操作過程中嚴格按照操作說明進行操作，注意無菌操作，即可得到準確可靠的結果。（7）用途廣。可用于醫院、疾病防治中心及血液中心的血液、干細胞產品等許多樣品中的真菌的檢測。　

北京安貞醫院左大鵬主任對北京金山川科技發展有限公司生產的MB-80微生物快速動態檢測系統進行了詳細的性能評價，評價包括重復性、準確度和比對試驗。結果CV值為6.7%具有很好的重復性。與培養法進行了對比，結果見表1

 表1 關于真菌1-3-β-D葡聚糖檢測結果

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病人      臨床診斷         培養結果        檢測結果（pg/ml）

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65/M       肺炎           白色念珠菌           79.2        

73/M       肺炎           熱帶念珠菌           45.2        

22/F       肺膿腫         毛霉菌               480.9      

47/M       肺膿腫         煙曲霉菌             235.1      

69/M       肺炎           熱帶念珠菌           39.5        

72/F       尿路感染       光滑念珠菌           50.2       

76/M       腹瀉           白色念珠菌           22.4       

68/F       尿路感染       近平滑念珠菌         30.6         

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據第四軍醫大學西京醫院檢驗科張建芳，徐修禮，樊新，孫怡群等報道[25]應用MB-80微生物動態快速檢測系統及GKT-5M Set動態真菌檢測試劑盒定量檢測血漿中1-3-β-D葡聚糖的含量，正