方案12.5 溫胰蛋白酶解離組織
| 實驗方法原理 | 組織切碎后于胰蛋白酶中攪拌數小時，每隔半小時收集已分離的細胞，離心后加入含血清的培養基。 |
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| 實驗材料 | 組織 DBSS 粗制胰蛋白酶 D-PBSA |
| 試劑、試劑盒 | 生長培養基 皮氏平皿 |
| 儀器、耗材 | 培養瓶 離心管 瓶子 磁力攪拌機 鑷子 移液管 血球計數儀 |
| 實驗步驟 | 1. 將組織（1~5 g）移入加有新配制的無菌 DBSS （50 ml）的皮氏培養皿中，清洗。 2. 轉人第 2 個培養皿中，切除多余組織如脂肪或壞死組織，再轉移至第三個培養皿中。 3. 用手術刀交叉切成約 3 mm3 小塊。  4. 用彎頭鑷將組織移人預先稱重的離心管或容器（預稱重的50 ml 離心管兩個，或常規容器兩個）內。 5. 讓組織塊沉降。 6. 用 DBSS 重懸清洗組織塊，使組織塊沉降，去除上清液，如此重復 2 次以上。 7. 將離心管或容器再次稱重。 8. 將所有組織塊轉入一個空的胰蛋白酶（2.5 %粗制胰蛋白酶，用 D-PBSA 或正常生理鹽水配制）消化瓶中，用 D- PBSA （200 ml）沖洗容器或離心管。 9. 去除多余的液體，再加人 180 ml 的 PBSA。 10. 加入 20 ml 2. 5% 的胰蛋白酶（若需要也可加入其他酶包括膠原酶、透明質酸酶、脫氧核糖核酸酶）。 11. 在錐形瓶（胰蛋白酶消化用瓶子，250 ml 錐形瓶或攪拌瓶）內加入攪拌子（于試管中高壓消毒）。 12. 封住錐形瓶，放于攪拌器上，在溫箱或溫室內于 37°C 攪拌。 13. 每分鐘大約 100 轉，37°C 攪拌 30 min 。 14. 30 min 后，收集解離的細胞： (a)使組織塊沉淀。 (b)吸出上清液放入離心管中，放于冰上。 (c)向錐形瓶中加入新的胰蛋白酶溶液消化剩余的組織塊，繼續攪拌并孵育 30 min 。 (d)將步驟 14b 的細胞懸液以 500 g 離心 5 min ，以收集細胞。 (e)用 10 ml 含血清培養基重懸細胞閉，儲存于冰浴。 15. 重復步驟 14 的過程直至組織塊完全消化或已看不出進一步消化的跡象（大約3~4 h )。 16. 收集冷藏的細胞懸液，用血球計數板或電子記數儀計數細胞，檢査細胞活性。 17. 細胞群體為異源性，由于校準口徑較閑難，最初使用電子計數儀時需要用血球汁數板來確認。 18. 用無菌棉布或自制的篩網過濾，去除大的聚集物。  19. 將細胞懸液用生長培養基（含血清的生長培養基（如：DMEM/F 12 加10%胎牛血清））稀釋，使每毫升培養基含有 1×106 個細胞。接種于培養瓶中，大約每平方厘米為 2×105 個細胞。當存活率不明確或難以預知時，細胞計數意義不大（如腫瘤活檢時，死亡細胞的比例很高）。在這種悄況下，建議按每毫升 5~25 mg 組織的濃度接種。 20. 每隔一段時間更換一次培養基（2~4 天，以 pH 下降為標準）。由于部分細胞黏附較慢甚至易于懸浮生長，所以丟棄上清液前要先檢查上清液中是否含有存活細胞。 |