溶血空斑形成試驗

血清

PBSSRBCRPMI1640

平皿燒瓶水浴箱華氏管注射器篩網青霉素瓶離心管加樣器

1.  底層瓊脂平皿的制備

將1.4 ％瓊脂加熱融化后傾注于平皿內，每個平皿6 ml，凝固后置濕盒37 ℃備用。

2.  0.7 ％瓊脂加熱融化后加入華氏管內，每管2 ml，47～49 ℃水浴保溫備用。

　　
3.  免疫小鼠脾細胞懸液制備

用4×10³個綿羊紅細胞（SRBC）鹽水懸液腹腔免疫小鼠，對照為等量生理鹽水。4 天后，小鼠拉脫頸椎處死，取出脾臟，用RPMI164。洗一次后置平皿中不銹鋼篩網上，用注射器針芯研磨成懸液，洗滌兩次，調整細胞數為3～8×10⁶ /ml。臺盼蘭染色查活細胞數應大于 90％。置4 ℃冰箱備用。

　　
4.  試驗平皿的制備

依次將預溫40 ℃左右的25 ％SRBC、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存于4 ℃的脾細胞懸液各0.1 ml加入預熱47～49 ℃的含0.7 ％瓊脂的華氏管中，迅速混勻，立即傾注于鋪有底層瓊脂的平皿內，凝固后，置37 ℃孵育1 小時。

5.  加入1∶5～1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5～1.0 ml，使其均勻覆蓋表面，再次置37 ℃溫育30 分鐘，即可用肉眼或借助于放大鏡進行空斑計數。

1.  0.7 ％瓊脂必須置47～49 ℃水浴融態保溫。如溫度過高會導致SRBC溶血或所加入脾細胞的死亡。溫度過低則在操作過程中瓊脂發生凝固，影響上層瓊脂平板的制備。

2.  離體的脾細胞應置4 ℃冰箱保存，防止抗體分泌和細胞死亡。

　　
3.  在制備試驗平皿時，對于所有玻璃器皿和各種試劑，均需預溫，各種試劑加入華氏管后，應與0.7 ％瓊脂迅速充分混勻，然后立即傾倒于底層瓊脂上，并避免傾入氣泡。

　　
4.  加入的補體應均勻覆蓋于表層瓊脂上。

　　
5.  制備底層平皿和試驗平皿時，均須將平皿置于水平臺上，以保證瓊脂面鋪平。