ITC 結果清楚地顯示，當檢測池中的蛋白樣品包含 ATP 時，化合物結合激酶的親和力沒有變化。 焓值指示盡管對親和力沒有影響，但是對結合的焓有顯著影響。 因此這些結果表明，該化合物在 ATP 結合方面是非競爭性的，而在存在 ATP 時結合模式可能有些變化。 這不僅強調了 ITC 在表征化合物結合的詳細機制中是有用的，而且突出了這種技術在親和力和結合焓測量中的雙探測性質。 在一個類似實驗中，對于與相同蛋白質激酶結合的不同試驗化合物，觀察到其在 ATP 方面的抗競爭動力學。 在不存在 ATP 時 KD值大于 50 μM（在標準 ITC 試驗中是不可測量的），而在存在 ATP 時 Kd 測量值為 0.7 μM （圖 4）。
圖 4：抗競爭性抑制劑結合滴定。 試驗化合物與蛋白質激酶和 ATP 的復合物結合的滴定。 參數值為 KD =0.56 μM，.H = -2.3 kcal/mol，n = 1.4。 在不存在 ATP 時沒有觀察到結合。
另一個實驗也顯示了能夠直接監測與單個蛋白質復合物結合的優點，在這里我們猜想化合物對一個信號通路中的兩個相鄰激酶的復合物有高親和力。 ITC 允許要研究的化合物單獨結合上游激酶，也可以結合上游和下游激酶的復合物，前提是先證明的確形成了該復合物。 對于化合物與復合物的結合，經證實親和力有 5 倍的增加（圖 5）。
圖 5：化合物結合上游激酶（紅線）以及結合這個激酶與其下游底物激酶復合物（藍線）的比較。 對于與復合物的結合，證明親和力有 5 倍的增加。
總結
量熱法已經被證明在蛋白質激酶抑制研究中具有十分寶貴價值。 該方法可以促進靶蛋白的質量控制檢查以及有助于抑制劑結合機制的詳細研究。
高通量和自動化儀器的出現為這些應用增加了價值，例如 Malvern MicroCal AutoiTC200和 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC 系統。 而向更少的試劑消耗方向的努力將確保量熱法廣泛應用在合理的藥物設計過程中。
作者致謝
Geoff Holdgate，Astra Zeneca Pharmaceuticals（英國麥克爾斯菲爾德阿爾德利公園梅勒塞德，SK10 4TG）全球化合物科學、先導物生成-研發能力與科學部門首席科學家