牙髓干細胞的分離培養——牙髓干細胞／乳牙干細胞原代培養

牙髓組織

滅菌PBSAMSC培養基膠原酶中性蛋白酶免疫磁珠分選時所需試劑：含1%BSA的PBSA與DPSC反應的一抗用STRO-I(小鼠抗人MSC;IgM)CC9(小鼠抗人CD146 MUC-18;IgG2a)或3G5(小鼠抗人外膜細胞；IgM)

羊抗小鼠IgG-結合或大鼠抗小鼠IgM-結合磁珠培養瓶和培養皿手術刀片和刀柄70μm細胞濾網非滅菌器材 用于免疫磁珠分選 回轉式混合儀DynalMPC?-1磁分離器

(a)用手術刀片將牙髓組織切成小碎片。

(b)將剪碎的組織放入膠原酶/中性蛋白酶混合溶液中（1:1)。

(c)37℃孵育30?60min，間歇地搖勻組織/消化酶混合物。

(d)消化后，加人足夠的MSC培養基，終止酶的活性。

(e)將懸液經70μm細胞濾膜過濾，去除細胞碎片，得到單細胞懸液。

(f)500g離心6min。

(g)倒掉上清液，用MSC培養基重懸細胞。然后進行免疫磁珠分選:和能與DPSC細胞反應的一抗孵育，包括STRO-I(小鼠抗人MSC;IgM),CC9(小鼠抗人CD146/MUC-18;IgG2a)，或3G5(小鼠抗人外膜細胞；IgM)，20Mg/mL,冰上孵育lh。用含1%BSA的PBSA洗兩遍，600g離心6min。羊抗小鼠IgG或大鼠抗小鼠IgM結合磁珠的任意一個二抗孵育，4℃回轉式混合儀40min。根據產品說明書推薦的方案，通過DyndMPC?-1磁分離器分離結合磁珠的細胞。

(h)細胞計數，按（1?10)×10³個細胞/cm²密度接種到培養瓶或皿上。

(i)在MSC培養基、37℃和5%CO₂的培養箱中培養。

(j)細胞分離后7天，用PBSA洗培養瓶，更換培養基。之后可以一周兩次更換培養基，直至細胞達到匯合。