特異性抗原誘導的細胞毒性T細胞功能測定

B淋巴母細胞株血液樣品

絲裂霉素CPBSRPMI 1640培養基

24孔培養板離心機培養箱

1. 特異性CTL的誘導和制備

①  取作者外周血分離PBMC，無血清1640洗兩遍，用含20%的新生牛血清的RPMI 1640調成1.5×106 /ml，置于24孔板中，于5% CO2 培養箱中4小時使單核細胞貼壁以去除之，然后收集細胞，計數；

②  取EB病毒轉化的B淋巴母細胞，加入絲裂霉素C，最終濃度為30μg/ml，于37℃水浴中作用30min，1000r/min離心10min，棄上清，沉淀細胞用1640液洗滌3次并計數；

③  取2×106 個PBL于24孔板中，加入5×104 （2.5%）個經絲裂霉素C處理（30mg/ml、30min）的自身、同種異體（其HLA-I類型別完全不同）的EBV-LCL細胞作為刺激細胞，混勻，用完全培養基（RPMI 1640）補總體積至2ml；

④  靜置于培養箱中；4d后半量換液，繼續培養3d；

⑤  離心收集細胞，取1×106 個反應細胞，加入2×105個（20%）的刺激細胞，第三天加入重組IL-2，使終濃度為30U/ml；每三天半量換液一次并維持相同IL-2濃度。

⑥  每周按相同程序刺激效應細胞一次，3~4次后，效應細胞即為特異性CTL，可用于殺傷實驗。

2. 細胞毒試驗

檢測CTL細胞毒作用均可采用檢測NK細胞殺傷活性的方法，僅效靶細胞比例不一樣，現將LDH釋放法簡要敘述如下：

①  靶細胞為用作刺激細胞的自身或同種異體EBV-LCL細胞，調成1×105/ml；

②  效應細胞為上述誘導的特異性CTL，調成2.5×106/ml；

③  各取0.1ml于96孔板中（效/靶比值為25:1）；輕輕吹打，使二者混勻；同時設靶細胞自然釋放對照組（即只加靶細胞而不加效應細胞）和最大釋放對照組（0.1ml靶細胞和0.1ml 1% NP-40）；

④  1000rpm/min離心2min后，置37°C、5% CO2 培養箱中孵育4hr

⑤  酶促顯色反應：參見“NK細胞殺傷實驗”。

1.對細胞的誘導和制備中，要使得單核細胞貼壁去除，然后才開始收集細胞，防止細胞污染。

2. 設置對照組，防止產生假陽性或假陰性等結果。

3. 生物污染會導致細胞增殖功能的降低

1. 使用冷凍細胞時，需要復蘇后檢測細胞的活力。

2. 培養液中加的血清，有些血清可能抑制反應。

3. 本底應小于2000rpm，陰性對照組應該大于20000rpm。