玫瑰花環試驗

實驗概要

本實驗介紹了玫瑰花環試驗的原理、方法和注意事項等，玫瑰花環試驗是目前鑒定和計算外周血液和各種淋巴樣組織中T淋巴細胞的最常用方法之一。

實驗原理

動物T淋巴細胞表面具有結合異種動物紅細胞的受體，稱為E受體，在體外一定條件下，能與綿羊等動物的紅細胞結合，形成以T細胞為中心，紅細胞環繞在周圍，宛似一朵玫瑰花樣的花環，故取名為E玫瑰花環試驗(erythrocyte rosettes assay)或自然花環形成試驗。凡能與RBC形成E花環的淋巴細胞稱E花環形成細胞(Erosette forming cell，ERFC)。目前公認綿羊紅細胞(SRBC)受體是人、騾、牛、山羊、豬等T淋巴細胞的特異標志，ERFC就是T細胞。這種玫瑰花環形成不需任何物質的刺激，故也稱自然玫瑰花環形成試驗。

在E玫瑰花環形成試驗中，當一定比例的淋巴細胞與綿羊紅細胞混合后，不放置冰箱中孵育，早期離心、鏡檢，可見一部分T細胞與SRBC形成玫瑰花，稱之為“活性玫瑰花(active rosette)”，或稱為“早期玫瑰花(early rosette)”；而放置低溫4℃孵育后，形成的玫瑰花稱為總玫瑰花(total rosette)或晚期玫瑰花(late rosette)。

早期玫瑰花環形成的T淋巴細胞是對SRBC具有高度親和力的T細胞亞群，它與T細胞的體內外功能活性密切相關，能更敏感地反映機體細胞免疫的水平和動態變化，是目前檢測細胞免疫水平最為簡便快速的方法之一。在總玫瑰花環試驗中，靜止期和活動期的T淋巴細胞，均能與不同數量的SRBC自發形成E花環，所得E花環的百分率和絕對數可代表被檢標本中全部T淋巴細胞的百分率和總數。

主要試劑

1. 抗凝劑200u/ml肝素生理鹽水溶液或38%檸檬酸鈉液。

2. 豚鼠抗凝血及家兔脫纖血或阿氏液保存的血液。

3. 淋巴細胞分層液比重為1077～1078(或1082～1084)。

4. 吸收滅活小牛血清小牛血清56℃ 30min滅活后，取2體積的小牛血清，加1體積壓積的家兔紅細胞，混勻，置37℃水浴30min，離心沉淀，吸取上清液，4℃冰箱保存。

5. 無鈣鎂Hanks液，pH值7.4。

6. 固定劑0.8%戊二醛。

7. 染液配制方法：

Ⅰ液瑞氏粉0.1g，甲醇60ml，研碎混勻。

Ⅱ液姬姆薩氏粉0.5g，純甘油33ml，甲醇33ml，先將姬姆薩氏粉溶于甘油中，并置60℃溫箱中(或水浴中保溫15～2h)，最后加甲醇即可。

使用時，分別將Ⅰ液和Ⅱ液用pH值6.4 PBS稀釋1倍。

實驗步驟

1. 1%家兔紅細胞懸液的制備  取家兔脫纖血或阿氏液保存的血液，以Hanks液洗三次，2000 r/min離心10min后，將壓積紅細胞用Hanks液配成1%懸液，含紅細胞數約為1×10⁸/ml。

2. 豚鼠淋巴細胞的分離  取肝素抗凝血10ml，加等量Hanks液稀釋后，用毛細吸管沿管壁緩緩加入裝有淋巴細胞分層液的試管內，使血液重疊于分層液上，用水平離心機以2，000 r/min離心30min。此時紅細胞沉降至最下層，上層為血漿，中層為分層液，血漿與分層液的界面有一白色狹帶為淋巴細胞和單個核細胞層。用毛細吸管吸取界面處的淋巴細胞與單個核細胞，置于離心管中，用Hanks液洗滌，1 000 r/min離心10min，反復1次，最后用Hanks液配成1×10⁷個細胞/ml濃度的細胞懸液。必要時可用臺盼藍試驗進行存活率檢查，應在95%以上(活細胞不著色)。

3. 玫瑰花環形成試驗取上述淋巴細胞懸液0.3ml，加入1%家兔RBC 0.3ml及滅活小牛血清0.1ml，混勻，37℃水浴保溫25min，取出以500 r/min離心5min，棄上清，留少許液體，即可用此細胞液涂片或滴片進行觀察，此時見到的玫瑰花環即為活性玫瑰花(Ea)。

如將此細胞液置4℃冰箱中作用2h(或過夜)取出后，再加入0.8%戊二醛2滴，輕輕旋轉試管，使沉淀的細胞重新懸浮，用毛細管輕輕混勻。此時觀察到的玫瑰花環為總玫瑰花(Et)。

4. 制片、鏡檢及結果

   1) 濕片：取上述細胞液一滴加于事先鋪有瑞氏染液的玻片上，覆以蓋玻片，在高倍鏡下觀察，凡吸附4個或更多家兔紅細胞的單核細胞，為RE花環形成細胞，共計數200個細胞，算出百分率。

   2) 干片：取培養物1滴于載玻片上，涂片、干燥，滴加甲醇固定5min，用pH值6.4 PBS沖洗，加Ⅰ液染4min，沖洗，再加Ⅱ液染4min，沖洗，待干，鏡檢。紅細胞染成紅色，淋巴細胞染成藍色。可見淋巴細胞周圍吸附有不同數量的紅細胞，呈玫瑰花環狀。

注意事項

1. 試驗用家兔紅細胞要新鮮，最好采血后當天使用，但阿氏液保存的血液也不宜超過兩周。

2. 因為只有活淋巴細胞才能與家兔紅細胞形成玫瑰花環，因此試驗用血液要新鮮，隨采隨做。

3 .試驗中加入1%小牛血清，能增加玫瑰花環形成的穩定性。用前須將血清以家兔RBC吸收，以去除對家兔紅細胞的天然抗體，否則抑制玫瑰花環的形成。

4. 分離豚鼠單個核細胞所用分層液的比重大小與細胞獲得率密切相關，一般以1082～1084最為適宜。

5. 淋巴細胞與家兔紅細胞比例以1∶40～1∶80較為適宜。

6. 用木瓜蛋白酶處理的家兔RBC作RE花環試驗，所得RE花環率有一定程度的提高。

7. 各淋巴細胞表面的紅細胞受體數量和對紅細胞親和力的程度有所不同，即使在同一實驗條件下，吸附紅細胞的數目也不同。試驗中可見到各種形式的花環，如環形花環，即整個淋巴細胞表面均吸附有紅細胞，一般在8個以上；不整形花環，即淋巴細胞表面有部分空缺，一般吸附4個細胞以上；有些淋巴細胞僅吸附1～3個紅細胞。為避免可能因紅細胞重疊在淋巴細胞上而造成誤差，故應選擇吸附3個以上紅細胞為ERFC。