| 實驗方法原理 | 溫度高時瓊脂呈液態，但在37℃ 時成凝膠狀態，細胞懸浮在溫暖的瓊脂凝膠培養基中，待瓊脂形成凝膠后進行培養，形成散在集落，很容易分離。 |
|---|---|
| 實驗材料 | Noble瓊脂 Difco 胎牛血清 |
| 儀器、耗材 | 兩倍濃度培養基 生長培養基 無菌超純水 無菌錐形瓶 吸管 通用容器 培養皿 水浴 三角瓶 托盤 電子細胞計數儀 本生煤氣噴燈 |
| 實驗步驟 | 1. 在培養皿底皿側面編號或做好標記，將培養皿放在托盤中，很方便。 2. 準備含 40 % FBS 的 2× 培養基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培養基配 2× 培養基，取半量所需終液量，加兩倍濃度的血清），保持 37℃。 3. 稱取 1.2 g 瓊脂。 4. 分別在無菌錐形瓶和另一個無菌瓶中加 100 ml 無菌 UPW。將 1.2 g 瓊脂放人錐形瓶中，蓋好，煮沸 2 min 。另一種方法是，提前高溫滅菌瓊脂。但若已保存起來，使用時仍需煮沸溶解或微波爐融化備用。 5. 將煮沸過的瓊脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。 6. 2× 培養基和 1.2 % 瓊脂等量混合制備 0.6 % 瓊脂底層，保持 37°C 。如果需要任何的生長因子、激素或其他添加物，應在此時添加至底層瓊脂培養基（生長培養基，1×，用于細胞稀釋）內。  7. 在培養皿中加人 1 ml 0.6 % 的瓊脂培養基，晃勻，確保培養基覆蓋整個培養皿底。置于室溫定型。  8. 制備細胞懸液，計數。 9. 準備 0.3% 瓊脂培養基，保持 37°C 。此培養基可以用 37°C 的 2× 培養基、55°C 的 1.2 % 瓊脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制備。 10. 制備以下稀釋濃度的細胞，使細胞的最大濃度為 1×105 /ml。 (a)1×105 /ml (b)將 1×105 /ml 稀釋 3 倍成 3.3×104 /ml (c)將 3.3×104 /ml 稀釋 3 倍成 1.1×104 /ml (d)將 1.1×104 /ml 稀釋 3 倍成 3.7×103 /ml 11. 將四種稀釋液的濃度分別標在 4 個小玻璃瓶或試管上，從每種稀釋液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 細胞液，分別放入相應容器內 37°C 加 4 ml 0.3% 瓊脂培養基，混勻，再從每個容器（通用容器，小玻璃瓶或離心管，稀釋細胞用）中吸出 3 個 1 ml 分別加在相應的三個培養皿上。最終濃度如下： (a)1×103 /ml/皿 (b)330 /ml/皿 (c)110 /ml/皿 (d)37 /ml/皿 加細胞之前， 確保上層瓊脂培養基有足夠的時間冷卻至 37°C 。 12. 待培養皿中的溶液在室溫下形成凝膠狀態。 13. 將培養皿放置在一個帶蓋的清潔塑料盒中，37°C 加濕溫箱中培養 10 天。 |
| 注意事項 | 準備培養基和細胞之前，先算出細胞稀釋度，在培養皿上做好標記，檢測一個細胞系的克隆形成率時，為每種稀釋度的細胞分別準備3 個培養皿。每個3. 5 cm 培養皿適宜接種的細胞數是1000、333、111和 37 個。也就是依次 3 倍的稀釋細胞懸液。如果需要加入生長因子、激素或其他添加劑，應加在下層的 0.6 % 瓊脂中。 |
| 其他 | 如果需要測定生長因子的活性滴度或選擇不同因子，在鋪底層瓊脂之前向培養皿內加入所需量的因子。 |