瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA

【實驗目的】 
通過實驗掌握瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的原理與方法。 

【實驗原理】 
瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種雜聚多糖，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷鍵相連形成的線狀高聚物（如下圖所示）。瓊脂糖遇冷水膨脹，溶于熱水成溶膠，冷卻后成為孔徑范圍從50nm到大于200nm的凝膠。
瓊脂糖凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段最為常用的方法之一，這種方法簡便易行。而且瓊脂糖可以灌制成各種形狀、大小和孔徑，在不同的裝置中進行電泳，如果有必要，還能夠從凝膠中回收DNA譜帶。 
瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣，選擇不同凝膠濃度和裝置，從50個堿基對到幾兆不同長度的DNA都可以實現分離。使用電場強度和電泳方向恒定的水平板瓊脂糖凝膠電泳的方法，可以很好的分離長度在50-20,000 bp 的DNA片段。

DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移率受多種因素影響。例如DNA分子的大小；瓊脂糖的濃度；所加電壓等等。DNA片段越長，泳動速度越慢，而且泳動速度與電場強度成正比。一個給定大小的線性DNA片段，在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移率不同，DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。 
用低濃度的熒光染料如溴化乙啶染色后，凝膠中的DNA可以直接被檢測出來。紫外燈下可以直接檢測到20pg的雙鏈DNA。 
【實驗材料】 
1. 實驗器材 
水平板電泳槽；灌膠模具及梳齒；電泳儀；55℃水浴；沸水浴；微量移液器 
2.實驗試劑 
（1）DNA樣品；DNA標準分子量標記物；瓊脂糖；1x電泳緩沖液TBE；6x樣品緩沖液 
（2）溴化乙錠：水中加入溴化乙啶，攪拌數小時至溶解。將配好的10 mg/ml溴化乙啶溶液裝在棕色瓶中，室溫保存，使用時稀釋至0.5μg/ml。 
緩沖溶液配制表

【實驗操作】
1. 照廠家說明準備好灌膠模具，置于水平面上（實驗操作示意圖如下）。
2. 配制1%瓊脂糖凝膠。取250ml三角瓶，加入100ml TBE緩沖液，稱取1克瓊脂糖加入緩沖液中，沸水浴加熱至完全溶解，然后在55℃水浴中保溫。在灌膠模具中插入梳齒，將稍微冷卻的凝膠倒入灌膠模具。凝膠厚度3~5mm，避免氣泡產生。
3. 室溫放置30~45分鐘，待凝膠完全凝固后，按照廠家說明將凝膠放入水平板電泳槽。4. 在電泳槽中加入電泳緩沖液，電泳緩沖液沒過膠面1mm，拔下梳齒形成樣品池。
5. 取樣品與6X樣品緩沖液按照比例混合后，用微量移液器緩慢加入樣品池中。
6. 蓋上電泳槽并且通電，注意電源正負極，確保樣品向陽極移動。恒壓1－5V/cm（按照兩極之間距離計算），至示蹤染料溴酚藍前沿距離凝膠前端25px時，切斷電源。
7. 從電泳槽中取出凝膠，將凝膠置于0.5ug/ml溴化乙啶水溶液中，室溫下振搖染色30~45分鐘。
8. 回收染色液，自來水沖洗凝膠后，于紫外燈下觀察。

【注意事項】 
1. 溴化乙啶是一種強誘變劑，并有中度毒性，取用含有這一染料的溶液時務必戴手套。 
2. 紫外線對人體，尤其是眼睛有危害性。為減少紫外線照射，必須確保紫外線光源受到遮蔽。