生物化學實驗常用技術:電泳技術

　　帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動的現象稱為電泳。如帶正電荷的粒子向負極移動，帶負電荷的粒子向正極移動。電泳技術是生物化學與分子生物學中的重要研究方法之一，利用電泳技術可分離許多生物物質，包括氨基酸、多肽、蛋白質、脂類、核苷、核苷酸及核酸等，并可用于分析物質的純度和分子量的測定等。

　　電泳的基本原理

　　許多生物分子都帶有電荷，在電場作用下可發生移動。由于混合物中各組分所帶電荷性質、數量以及分子量各不相同，使在同一電場作用下，各組分的泳動方向和速度也各有差異，所以在一定時間內，它們移動距離不同，從而可達到分離鑒定的目的。

　　一.泳動度

　　設一帶電粒子在電場中所受的力為F，F的大小決定于粒子所帶電荷Q和電場強度 E，即 ：F = E?Q

　　根據Stoke氏定律，一球形分子在非真空條件下(例如在溶液中)運動時所受的阻力(F′)與分子移動的速度(v)，分子半徑(r)、介質的粘度(η)有關，即：

　　F′ = 6πrηv

　　當 F=F′時，即達到動態平衡時：

　　E?Q = 6πrηv

　　移項得 v/E = Q/ 6πrη (1)

　　v/E 表示單位電場強度時粒子運動速度，稱為遷移率(mobility)，也稱電泳速度，以μ表示，即：

　　μ = Q/ 6πrη (2)

　　由式(2)可見，帶電顆粒的遷移率在電場中的泳動速度與本身所帶凈電荷的數量，顆粒大小、形狀和介質的粘度等多種因素有關，一般說，所帶的凈電荷數量愈多，顆粒愈小，愈接近球形，則在電場中泳動速度愈快;反之則慢。兩種不同的粒子一般有不同的遷移率，在具體實驗中，移動速度v為單位時間t內移動的距離d，即：

　　v = d/t

　　又電場強度E為單位距離內電勢差U(以伏特計)，L為支持物的有效長度，即：

　　E=U/L

　　以 v=d/t，E=U/L代入(2)式即得：

　　μ = Q/ 6πrη = v/E = dL/tU

　　式中：v為粒子的泳動速度(厘米/秒或分)，E為電場強度或電勢梯度(伏/厘米)，d為粒子泳動距離(厘米)，L為支持物的有效長度(厘米)，U為加在支持物兩斷的實際電壓(伏)， t為通電時間(秒或分)。故遷移率(或泳動度)的單位為厘米2·秒-1·伏特-1。

　　某物質(A)在電場中移動的距離為：

　　d A= μA tU/L

　　另物質(B)的移動距離為：

　　d B= μB tU/L

　　兩物質移動距離差為：

　　d A- d B = (μA - μB) tU/L (3)

　　式(3)指出物質A、B能否分離決定于兩者的遷移率。若它們的遷移率相同則不能分離，有差別才能分離，差別越大，分離越好。當然，也與其他實驗條件有關。

　　二.影響電泳的因素

　　電泳結果可受到多種因素的影響，但通常認為以下4個方面更為重要。

　　(一)電場強度

　　電場強度和電泳速度成正比關系。電場強度越高，則帶電粒子的移動越快。電場強度以每厘米的電勢差計算，也稱電勢梯度。根據電場強度的大小，可將電泳分為常壓電泳和高壓電泳，前者電場強度一般為2～10伏特/厘米，后者為20～200伏特/厘米。但電壓增加，相應電流也增大，電流過大時易產生熱效應可使蛋白質變性，必須有散熱措施，才能得到好的效果。

　　(二)介質的pH值

　　介質的pH值決定了帶電粒子解離的程度，也決定了該物質所帶凈電荷的性質和多少。對兩性電介質如蛋白質，介質的pH離開等電點越遠，所帶凈電荷越多，則泳動速度亦越快，反之越慢。若在等電點pH介質中，則不能移動。因此，當分離某一蛋白質混合物時，應選擇一個合適pH值，使各種蛋白質所帶的電荷量差別較大，以利于彼此分開。通常為保持介質pH的穩定性，電泳都在一定的緩沖液中進行。

　　(三)緩沖液的離子強度

　　緩沖液的離子強度低，電泳速度快，但分離區帶不易清晰;離子強度高，電泳速度慢，但區帶分離清晰。如果離子強度過低，緩沖液的緩沖量小，難維持pH的恒定;離子強度過高，則降低蛋白質的帶電量使電泳速度過慢。所以最適離子強度一般在0.05～0.1mol/L 之間。

　　溶液離子強度的計算：

　　I= 0.5ΣCiZi2

　　式中：I為離子強度;Ci為離子的摩爾濃度;Zi為離子的價數;Σ表示"加和"的符號。

　　(四)電滲作用

　　在電場中，液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲。如在紙電泳中，濾紙中含有表面帶負電荷的羥基，因感應相吸而使與紙相接觸的水溶液帶正電荷，在電場中液體向負極移動，并帶動著物質移動。由于電滲作用與電泳同時存在，所以電泳的粒子移動距離也受到電滲影響，如果物質原來向負極移動，則移動更快，反之則慢，所以電泳時粒子表面速度是其本身泳動速度與由于電滲而被攜帶的移動速度兩者的加和。例如，在pH8.6巴比妥緩沖液中進行血清蛋白紙電泳時， γ-球蛋白雖然也同其它主要血清蛋白質一樣帶有負電荷，應向正極移動，但它卻向負極方向移動。這一結果是由電滲作用引起的。選擇電泳支持物時，以電滲作用小或幾乎無電滲作用的為宜。

　　三.電泳的分類

　　電泳可分為顯微電泳，自由界面電泳和區帶電泳三種，其中區帶電泳操作簡便，容易推廣，因此常用于分離鑒定。區帶電泳又稱區域電泳，即電泳在不同的惰性支持物中進行，使各組分成帶狀區間。區帶電泳的形式，僅按某一特點分類似乎都不全面。這里基于支持物的物理性狀、裝置形式、pH值的連續性等不同，可分為：

　　(一)按支持物物理性狀

　　1. 濾紙及其它纖維素薄膜電泳 如紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳。

　　2. 凝膠電泳 如瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳，制成凝膠板或凝膠柱。

　　3. 粉末電泳 如纖維素、淀粉、瓊脂粉等，將粉末與適當的溶劑調和，鋪成平板。

　　4. 線絲電泳 如尼龍絲、人造絲電泳，是一類微量電泳。

　　(二)按支持物的裝置形式

　　1. 平板式電泳 電泳支持物(如凝膠)制成水平板狀。

　　2. 垂直板式電泳 板狀支持物，在電泳時，按垂直方向進行。

　　3.連續—流動電泳 首先應用于紙電泳，將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，緩沖液和樣品自頂端下流，與電泳方向垂直。也可以用其它材料作支持物。該法主要用途是制備一定量的電泳純物質。

　　4.圓盤電泳 電泳支持物灌制在兩通的玻璃管中，被分離的物質在其中泳動后，區帶呈圓盤狀。

　　(三)按pH的連續性