生物實驗中PCR技術原理與PCR條件對反應的七大影響

 PCR（Polymerase Chain Reaction）：又稱聚合酶鏈式反應，其基本原理是酶促DNA合成反應，即在模板DNA、因為和脫氧核糖核酸存在下，在耐熱DNA聚合酶作用下，經過DNA鏈熱變性、引物退火和引物延伸三個步驟，循環往復，使DNA片段在短時間內迅速擴增。它具有特異、敏感、高產率、快速、簡便、重復性好、自動化等突出特點，在分子生物學和醫學領域迅速得到廣泛應用。

    PCR條件對反應的七大影響有：

    一、變性溫度與時間

    模板變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復性，從而減少產量。變性溫度太高，又會影響酶的活性。一般情況下可設為94℃ 20-30 s，高溫變性溫度不宜超過95℃。

    二、退火溫度與時間

    退火溫度決定PCR特異性與產量。溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設置特定反應的zui適退火溫度，可根據引物的（G+C）%含量進行推測，一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時間一般為30-60 s，足以使引物與模板之間完全結合。

    三、引物

    引物與模板錯配對的長度應至少為17個核苷酸，zui高不宜超過30個核苷酸，zui佳長度為20-24個核苷酸，如需插入酶切位點，應在酶切位點5’端加保護堿基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量應盡量相近。引物內部應避免形成明顯二級結構，如發夾結構。兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3’端的延伸。人工合成的引物需經色譜層析或PAGE純化以除去未能合成至全長的短鏈雜質。引物的終濃度一般為0.1-1μM，濃度太高會導致非特異性擴增，濃度太低則擴增產物太少。

    四、酶量

    50μl反應體系可用0.5-5U酶，酶量的選擇與模板DNA的量、擴增片段大小等有關，酶量過多易發生非特異性反應，而且可能增加突變機率，尤其在進行高保真擴增時，盡量減少酶量，但酶量過少時反應性能會下降。

    五、延伸溫度與時間

    PCR反應的延伸溫度一般選擇70-75℃之間，延伸時間根據所選聚合酶擴增速度和擴增片段大小設定，如同樣擴增2kb片段，使用Taq酶只需1min，使用高保真酶則需2min以上。延伸時間過長會導致非特異性擴增，時間太短則可能得不到擴增產物或得到一些短的非特異性片段。

    六、循環次數

    可根據模板的量，擴增片段的大小和擴增產物的下游應用等因素，設定30-40個循環。循環次數太少，擴增量不足，如果循環次數太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以在保證產物得率的前提下，應盡量減少循環次數。

    七、模板

    模板可以是單鏈DNA也可以是雙鏈DNA，質粒DNA的擴增效率略低于線狀DNA。模板加量一般不需太多，不超過1μg為宜，因為模板量過多可能導致非特異性擴增增加，但同時要考慮模板中靶序列的含量。