生物顯微鏡的成像原理（一）

生物及醫用顯微鏡可分為光學放大及電子放大兩大類。前者按用途可分為普通型、特種型、型顯微鏡和手術顯微鏡。普通型生物顯微鏡僅供一般用途使用，通常的農用與醫用顯微鏡、倒置顯微鏡均屬這一類。特種型生物顯微鏡可作某些專用的觀察和研究。暗場生物顯微鏡、熒光顯微鏡、偏光顯微鏡、相襯和干涉相襯顯微鏡等均屬于這一類。型生物顯微鏡系指大型多用途的生物顯微鏡，研究用生物顯微鏡和研究用生物顯微鏡等屬于這一類。

顯檄鏡放大成像系統

顯微鏡光學系統由物鏡和目鏡兩部分組成。因為被觀測的物體本身不發光，而借助于外界照明，故顯微鏡需要有一個照明系統，這些部分都是由較復雜的透鏡組成，尤其物鏡更為復雜。

圖3—1是顯微鏡成僚的光路原理團，圖中的物鏡和目鏡均用薄透鏡表示。

顯微鏡的物體AB處于物鏡的2倍焦距之內一倍焦距之外，它首先通過物鏡成一大的倒立實像4’B’，且使之位于目鏡的物方焦平面上或焦平面以內很靠近的地方，然后目鏡將這一實像再次成一個正立虛假A”B”擴于無限遠或人眼明視距離之外，以供眼睛觀察。顯微鏡對物體進行2次放大，因此與放大鏡相比，具有更高的放大倍率，能觀察到肉眼所不能直接觀察的微小物體，分辨更細小的細節。在這里目鏡相當于放大鏡．只不過這時放大鏡的物是物鏡所成的像而已。由于物鏡所成的像是實保，因而可在實像處（即目鏡的物方焦平面處）安放各種用途分劃板，供對準或測量用。

二、顯微鏡的放大率與分辨本領

1．顯微鏡的分辨本領

分辨本領主要指接物鏡分辨被檢查物體細微結構的能力，也就是說在顯微鏡下別的zui小微粒的大小或兩點之間zui短距離及某物點zui小直徑的限度，便叫做顯微鏡的分辨本領，或稱為鑒別率。通常用d表示：

從式中可知，顯微鏡的分辨率主要取決于光的波長和數值孔徑這兩個因素。d值越小，分辨本領也就越強，越能看清物體的細微結構。鑒別率計算單位是Mm。

生物顯微鏡的鑒別率的提高只有兩個辦法：

（1）增大物鏡的數值孔徑（鏡口率）。從圖3—2可以看出，影響數做孔徑（nsina）的因素有兩個：其一為物體上某點射人物鏡光錐角（鏡口角）的一半（sina）；其二為檢品與物鏡間媒質的折射率n。即數值孔徑為NA＝nsina。鏡口角半數zui大能到90°，故sina的zui大值為1.00，這時物鏡的焦距zui短而曲度也很大，制造上是極為困難的。即使能辦到，在干燥系中的鏡口率只有l×sin90°＝1.00空氣n=1）o若再增大鏡口率便只有從媒質著手，所以便有水、甘油，石蠟油和香柏油等浸潤均勻媒質的應用，確實改進了鏡口率不少，它zui高可到1．40。如果用溴榮液可達1．67左右，更接近蓋片和透鏡的折射率。

（2）縮短光源的波長：采用紫外線作光源，波長可到0.1υm，這樣放大倍數比自然光放大的倍數大3—4倍，普通紫外線光波在0.2υm左右，即使能產生出0.1υm波長的紫外線，一般透鏡也將把它吸收干凈，無法利用。 

顯微鏡的zui大數值孔徑可達1.5υm左右，在這種情形下：

即在這種顯微鏡里，仍可分辨的兩點間zui短距離差不多等于所用光波波長的1／3。假定綠光的光波的波長λ＝5.46xl0ˉ5cm，那么顯微鏡能分辨的zui短距離為：

則這臺顯微鏡的zui高分辨距離也超不過0.182υm。向眼在明視距離（250M）能分辨的兩點之間zui短距離為0.1mm，約為上述d值的560倍，因此1臺光學顯微鏡的放大率有1000倍也就足夠了。這是因為光的本性及光的繞射現象就限制了顯微鏡的放大極限。凡是光波超過微粒直徑的2倍時，光線就很方便地繞過微粒而繼續前進，所以普通干燥系顯微鏡的zui大鑒別率只能達到光源波長的1／2，直徑小到0.2υm的微粒就無法被光學顯微鏡發覺。雖然后來應用浸潤系方法，如油鏡，提高了折射率，其鑒別率也只不過能提高到光源波長的1／3而已。而且還要用的透鏡才能達到。

2．顯微鏡的放大率

對于有一定大小的細節，除應該用適當的數值孔徑的物鏡而外，整個顯微鏡也應該有適當的放大倍數與之相適應，才能看清細節，這種放大倍率稱之為有效放大率。這是實際下作應該考慮的問題，每個物鏡都有它的有效放大率。

在使用生物顯微鏡過程中，每個物鏡都配多大的倍數的目鏡，應該特別注意。一般而言，顯微鏡的zui高放大倍數不得超過所使用物鏡鏡口率（NA）的1000倍，否則即產生畸變而失真。例如，其物鏡的放大倍數為lO×，為0.25，則0.25x1000＝250，即與這個物鏡配合使用的接目鏡其放大倍數不應超過25倍，因為25×10＝250。與油浸系配合的目鏡放大倍數應更小些，例如，有一個l00x，N?A為1．4，則1．4x1000＝1400，即接目鏡的放大倍數不應超過14×，因為14×100＝1400。通常總是低倍物鏡配合高倍目鏡，高倍物鏡配合低倍目鏡，便是這個道理。

目前生物顯微鏡一般油浸物鏡NA＝1.25或1.3左右，所以，一般放大1250或1350倍已經夠了，而zui大川為1．5，所以國家規定顯微鏡的zui高倍數為1250倍，而通常顯微鏡zui高倍咖良少超過1500倍。如果1臺顯微鏡zui高放大2500倍，實際上放大1000倍時有鑒別率。放大倍數太大，也是無效的．因為放大到一定限度后，把像再放大也不會使我們看到更小些的細節，如果勉強放大，只會使像變得模糊反而影響清晰。也有超過1500倍的，其實也就是目鏡倍數大了一些，這是為了照相或投影之用。

生物顯微鏡各物鏡有效放大率情況見表3—2。

4．幾個有關的概念

（1）顯微鏡的機械管長。是指從任何——個接物鏡的接合螺絲抵肩換器吻合處起，到接口鏡筒上緣止的這一段距離而言為機械管長。

如有抽筒則指還未被拉起的長度．抽筒可從150mm拉到250mm。在干燥系中是使用顯微鏡岡有的鏡筒長度或抑筒未被拉起的長度c油浸系則須拉抽簡拉到170M，當觀察不透明的物體時，便應拉到190mm或250mm，這也是機械管長。現在一般無抽筒顯微鏡或有抽筒而未被拉起時．多固定為160mm。

（2）生物顯微鏡的光學管長。是指從接物鏡的上焦面起，到接目鏡下主焦面止，這段距離而言為光學管長。

它的簡單測定方法：從接物鏡上組透鏡的亡面量到接目鏡的光欄環隔為止，約得1個近似數值。在干燥系情況下，多為140mm，也可小至128mm以下，油浸系則可高到180mm以上。光學管長關系著次級放大倍數，非常重要。

（3）顯微鏡的操作距離。是指接物鏡下端與蓋片之間的距離而言，為操作距離。

一般鑒別率小者則操作距離大，反之則小。因為操作距離大，鏡口角一定小，于是鏡口率也小，即吸收光量的能力弱，所以鑒別率就受到限制。反之操作距離小，則接物鏡與蓋片越接近，則鏡口角就大，而吸收光量也相應增大，鑒別率自然會增強。

一般顯微鏡的操作距離為16—0.65mm，但也有長至55mm而短至O.5mm的。

（4）明視距離。出于眼睛的調節作用，所看清楚的zui遠和zui近的兩點，分別叫遠點和近點，正常眼遠點無限遠處，近點在10—15cm。當物體距離眼睛25cm時，在人眼的視網膜上造的像zui為清晰。而且看起來不易感到疲勞，這個距離叫明視距離。顯微鏡的明視距離規定為25cm，就是這個道理。