材料與方法
細胞培養
于標準條件下進行腫瘤細胞系（ACHN、Caki、SJSA、PANC-1、MDA-MB231、AsPC-1、SK-MES、NCI-H322M、22RV1）培養。使用TWEAK或
Anti-TWEAK（RO5458640）分別對細胞進行處理。于不同時間點收集腫瘤細胞系（0、6、24
小時），將RNA樣本存放（Qiagen）。
細胞 RNA 分離
使用MagNA Pure LC 儀、MagNA Pure LC
RNA Kit –High Perfor-mance（Roche，貨號：03 542 394 001），與MagNA Pure LC
程序“RNA HP Cells”從細胞小球中分離總體細胞 RNA。溶解并混合細胞裂解物（1 x 106細胞每 600 μl RLT
緩沖液[Qiagen，貨號：79216]），并將 2 x 200 μl細胞裂解物轉移至MagNA Pure Sample Cartridge
wells（200 μl每孔）。洗脫裂解液重復分離制備的 RNA 至 50 μl，并收集洗脫液。FFPE 組織 RNA 分離使用 High
Pure RNA Paraffin 試劑盒（Roche，貨號： 03 270 289 001），根據操作手冊（福爾馬林固定、石蠟包埋組織 RNA
分離方案），從10um FFPET 切片中分離總體細胞 RNA, 經過調整的技術操作步驟如下：1 x 蛋白酶 K 85°C 消化 30
分鐘；第二次添加蛋白酶 K 55°C 消化 30 分鐘；室溫 High Pure 柱上DNase處理 15
分鐘。經過調整的技術操作步驟更加快速、上機時間更短，顯示其性能具有可比性。
RNA 質量控制
使用NanoDrop儀器進行RNA制備物質量與定量分析。使用Agilent生物分析儀與RNA Nano芯片進行某些樣本RNA完整性分析。
cDNA合成
使用Transcriptor Universal cDNA Master（Roche，貨號：05 893 151 001）與 1ug 總體RNA進行cDNA合成。每份樣本均建立3份獨立的40μl反應液。逆轉錄系列RNA稀釋液，并分別進行濃縮產物PCR。
實時qPCR
進行 1g 總 RNA 3
份cDNA合成反應混合液、稀釋處理，并將其作為模板，用于RealTime ready Custom Panel Plate,
384（Roche，貨號：05 582 873 001）。使用LightCycler? 480 Probes
Master（Roche，貨號：04 707 494 001）進行含有RNA的反應混合物制備。
每孔總體PCR反應容積是10 μl，終RNA容量是10ng。羅氏公司為每個儀器配備有LightCycler? 480 軟件，版本1.5，以及content.txt文件，從而使樣本設置與結果分析更加容易。
結果與討論
NF-kB RealTime ready Custom Panel體外細胞系研究篩選出35種差異表達基因。
為生成首個預測性與藥效學標志物假設，我們使用一種多參數panel（92 種靶序列與 4 種看家基因），該panel涵蓋有 NF-kB途徑，以及廣泛的基因表達篩查方法。使用該panel是為建立高通量工作流程，并使操作更加方便。使用相關復合物處理過的腫瘤細胞系，進行首個體外研究。以MagNA Pure LC 儀器自動 RNA 分離、具有RealTime ready NF-kB定制型多孔檢測板的、384-孔格式的LightCycler? 480 儀器 RT-qPCR與cDNA合成為起點，使工作流更加便利、快速，并進行相關基因表達分析。
工作流描述：NF-κB RealTime ready 定制型多孔檢測板體外研究
