生物樣本冷凍儲存技術（一）

1 儲存溫度

    生物樣本的長期儲存通常使用盡可能低的溫度來降低樣本內的生化反應提高樣本內各種成分的穩定性。生物大分子、細胞、組織和器官的常用儲存溫度有-80⁰C（超低溫冰箱）, -140⁰C（液氮氣相或深冷冰箱）以及-196⁰C（液氮液相），溫度越低樣本的穩定保存時間越長。0～-60⁰C是水的結晶溫度，容易對細胞和組織的微觀結構造成傷害，一般不使用這一溫度來保存組織和細胞。部分經過提純的生物大分子可以在0～-60⁰C穩定保存一定時間，但在組織樣本內生物大分子受到細胞組織內多種因素的影響，穩定性有可能明顯降低，所以通常樣本庫不使用0～-60⁰C作為儲存溫度。

溫度	意義	相關設備	生物樣品存儲應用
	0～-600C為組織和細胞內水的結晶溫度，溫度進入此范圍組織內的水開始結晶傷害細胞和組織微觀結構。	各種冷凍冰箱	可中長期保持經過提純的生物大分子的穩定性，但不能存保持組織中的生物大分子穩定性、細胞活性及組織微觀結構。
-800C為水的結晶溫度之下較為安全的溫度，同時樣本內的生化反應顯著減弱。也是目前自動化存儲設備所能使用的最低溫度。	超低溫冰箱	可中期保持組織內生物大分子的穩定性；短期保持細胞活性和組織微觀結構。
-1360C為水的玻璃化溫度，水的結晶對細胞和組織不再有明顯傷害，樣本內的各種生化反應幾近停止。	液氮箱/罐氣相； 深冷冰箱	可中長期保持組織內生物大分子、細胞和組織微觀結構的穩定性，為不少樣本庫推薦用于長期凍存組織。
-1960C為液氮蒸發的溫度，是常規方法所能實現的最低溫度。樣本內的各種生化反應可以認為停止，水的結晶對細胞和微觀組織的傷害可以忽略。	液氮箱/罐液相	可長期保持組織中的生物大分子穩定性、細胞活性及組織微觀結構，但對存儲耗材有較高要求。

-80⁰C樣本儲存

    -80⁰C低于危害性較大的水的結晶溫度范圍，也是常用設備超低溫冰箱能達到的溫度，基于操作簡便性、儲存量和成本等因素來考量，這一溫度也是目前保存樣本中生物大分子活性的常用溫度。但對不同的生物大分子活性這一溫度下能保持多久仍無定論。組織中DNA的穩定性可以在-80⁰C下可以保持數年或更長時間。但對RNA來說，則容易被廣泛分布于細胞和各種組織里的RNA酶逐漸降解，在不同的細胞和組織中，RNA穩定儲存的時間長短也有較大的區別，但一般不超過5年，在一些敏感實驗內，RNA在-80⁰C下不到一年就發生了測得出的降解，所以為長期保存RNA活性，建議使用更低的溫度，或者利用小部分樣本提取RNA與剩余樣本同步儲存。其他樣本內的蛋白質和脂類等生物大分子在樣本內在-80⁰C下也能保存，但時間長短不一，穩定性逐漸衰減。如果為保護樣本里已知的特定生物大分子，也可加入該分子的穩定劑。如果樣本里要保存的生物大分子未定，建議使用更低的溫度儲存。另外目前常見的大型自動化樣本存取設備只能和-80⁰C超低溫設備配套使用，尚不能夠和液氮設備配套使用。英國的UK Biobank則是把一部分樣本的拷貝（～950萬）儲存在-80⁰C做工作樣本，使用自動化設備存；另一部分拷貝（～550萬）在另外一個地方儲存在液氮氣相中做安全備份，樣本手動存取。

-140⁰C樣本儲存

    -140⁰C是低于水的玻璃化溫度（～-136⁰C），也是液氮氣相和深冷冰箱能夠達到的溫度，樣本在這一溫度范圍內其生物學活動極大降低，是保存樣本中細胞活性的理想溫度。和冰水混合物能維持在0⁰C的相變溫度類似，絕緣的液氮容器內液相和氣相氮應該維持在相變溫度-196⁰C。但實際上由于液氮容器蓋子不夠密封，從而導致在液氮液面和液氮容器罐口之間形成一個溫度梯度。美國國家癌癥研究所建議液氮容器口處的溫度應保持在-140⁰C以下，未來用途未確定的樣本應以液氮氣相模式儲存，以保護組織內細胞活性。

深冷冰箱是電制冷，無需液氮，裝滿樣品后的穩定溫度通常在-140以下，和使用液氮氣相相比，其優勢在于不需頻繁添加液氮，維護方便。但電制冷的降溫速度低于液氮，一旦開啟容器取放樣品時容易造成較大范圍的溫度波動，溫度恢復時間也相對較長，因而更適合較少開啟取放樣品的情況。另外電制冷冰箱必須保障供電。在斷電情況下推薦使用液氮設備以提供備份儲存。

-196⁰C樣本儲存

    -196⁰C是液氮揮發的溫度，因而只有液氮液相保存技術能達到此溫度。樣本內的生命活動在此溫度下基本停止，樣本的穩定性可以得到長期的保存。是長期保存樣本內細胞活性、組織器官的復雜結構及活性的最有效方法，得到廣泛認可。與其它不同溫度冷凍模式相比，液氮容器液相儲存樣品需要進一步防護樣品間交叉污染。美國國家癌癥研究所推薦使用帶螺旋的凍存管封裝樣本。但在降溫過程中樣品從超低溫冰箱（-80⁰C）轉移到液氮中時驟然降溫，引起凍存管帽和管身收縮不一致，容易導致液氮滲入凍存管從而增加了樣品間交叉污染的風險。解決的辦法之一是可以使用專門的凍存管套對每個凍存管進行熱縮密封，或是使用密封膜在凍存管帽與管身接口處纏2-3圈再儲存。前一種方法會使管身加長而需要較高的凍存盒，第二種辦法會使管身略變粗，推薦使用底部間隔的10x10規格的常規凍存盒。

2 冷凍技術

    上世紀50-70年代Basil Luyet，James Lovelock，Peter Mazur等學者針對冷凍對細胞和組織的影響展開深入研究，發現損傷主要來源于冰晶損傷和溶液滲透壓損傷。隨著溫度的下降，細胞內外的水分結冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞壁破壞，從而導致細胞死亡。這種因細胞內部結冰而引起的細胞損傷即冰晶損傷（Intracellular ice damage）。冰晶損傷是由冷卻速度過快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。同時隨著溫度的下降，細胞外部的水分會先結冰，從而使得未結冰的溶液中電解質濃度升高，細胞膜上的脂質會因長時問暴露在高溶質的溶液中而受到損壞，細胞發生脫水滲漏，導致在復溫時大量水分滲入細胞內造成細胞死亡。這種因保存溶液溶質濃度增高而形成的細胞損傷被稱為溶液損傷（Solution damage）。溶液損傷是由冷卻速度過慢，使細胞在高濃度的溶液中暴露的時間過長而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴重。