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  • 生物氧化—乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的遞氫作用


    原理

    乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)普遍存在于全身各組織細胞,尤以肌肉細胞為甚。在有輔酶Ⅰ存在時,乳酸脫氫酶可使乳酸脫氫轉變成丙酮酸,其氫可經由輔酶Ⅰ、黃素酶傳遞給甲烯藍,使之轉變為甲烯白。由此產生的顏色變化即可認證乳酸脫氫酶的上述催化作用。

    乳酸脫氫酶催化乳酸與丙酮酸之間的可逆反應,本實驗采用KCN與丙酮酸反應生成丙酮酸氰醇而取走反應體系中的丙酮酸,于是反應便不斷朝著乳酸脫氫成丙酮酸的方向進行。

    操作方法

    1.輔酶溶液的制備:先將盛有6ml水的試管置于沸水浴中,約5分鐘后,取實驗用小白兔一只,靜脈注射空氣致死,迅速剪下腿部肌肉8-10克,去除筋膜,剪成碎塊,立即投放于沸水浴中的熱水試管里,煮沸4-5分鐘以破壞肌肉中酶的活性,這一步應盡量迅速。之后,取出試管,將內容物倒入乳缽中,研成細漿,兩層紗布過濾,收集濾液(內含備用的輔酶Ⅰ)。

    2.乳酸脫氫酶溶液的制備:再取小白兔腿部肌肉8-10克,置于乳缽中,加沙少許,加0.9%NaCl 8ml一同研成細漿,收集濾液(內含乳酸脫氫酶及黃素酶等)。濾液中加活性炭約0.5mg,混勻,放置15分鐘,并時時搖動,以吸去輔酶。最后,濾去活性炭,留取濾液備用。

    3.取試管4支,標上號碼,依次加入下列各溶液。

     

     

    管號 乳酸脫氫酶 輔酶Ⅰ 0.5%KCN 2%乳酸鈉 0.04%甲烯藍
    1 0.5ml
    0.5ml 0.5ml 2滴 0.5ml
    2 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 2滴
    3 0.5ml 0.5ml 0.5ml
    2滴 0.5ml
    4
    0.5ml 0.5ml 0.5ml 2滴 0.5ml

     

    將各管混勻,各加石蠟油10滴,覆蓋溶液表面,時時觀察各管的顏色變化。

    注意事項

    1.氰化鉀有劇毒,切不可用口吸取試劑,以免不慎入口中毒。

    2.在冬季,4只試管應插入40-50℃水浴中,以加快還原反應。

    3.肌肉組織也含有乳酸,因此上文所制的輔酶溶液和乳酸脫氫酶溶液中都含有若干的乳酸,第3管也能褪色,但褪色速率是較慢的。操作中,應嚴密注意觀察第2.第3管顏色變化的快慢。實驗中,甲烯藍及乳酸鈉的量應為最小量,如果太多,則顏色變化就難區別了

    試劑和器材

    一、器材

    實驗家兔、手術剪、電爐、燒杯、乳缽、漏斗、紗布、活性炭、試管和刻度試管。

    二、試劑

    0.5%KCN、2%乳酸鈉、.0.04%甲烯藍、0.9%NaCl、.石蠟油。


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