生物素酰化探針的制備實驗——切口平移法

DNA

DNA聚合酶dNTP2-疏基乙醇生物素甘油NaClEDTASDS無水乙醇

注射器電泳儀離心機培養箱

1.  混合以下物質于100 μl 反應體積：

（1）10 μl  10×大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ緩沖液

（2）10 μl  0.5 mmol/l 3dNTP混合液

（3）10 μl  0.5 mmol/l 生物素-11-dNTP貯存液

（4）10 μl  0.5 mmol/l 2-ME

（5）2 μg  DNA

（6）20 U  大腸桿菌聚合酶Ⅰ

（7）DNA酶Ⅰ貯存液，用錢用冷水稀釋1000倍

（8）加水到100 μl，15℃溫育2~2.5 h。

2.  取6 μl 反應液，煮沸3 min 置于冰浴2 min。

3.  加樣于瓊脂糖凝膠，同時帶對照分子量標準，在15 V/cm 電壓降下電泳。

4.  消化的DNA大小介于100~500 bp 之間，接步驟5繼續，若大小在500~1 000核苷酸之間（或更大）加入第二份DNA酶Ⅰ繼續溫育。

5.  加入2 μl，0.5 mol/l pH8.0的EDTA和1 μl 10%SDS，68℃加熱10 min 終止反應和滅活DNA酶Ⅰ。

6.  在1 ml 注射器中準備如Sephadex G-50離心柱，用2 ml 無水乙醇清洗注射器和硅化的玻璃棉。

7.  接著用4 ml H₂O沖洗，將G-50介質裝入注射器至刻度，用100 μl SDS柱緩沖液冼3~4次，上樣。

8.  分離生物素酰化的探針。探針濃度應約為20 ng/μl ，探針可直接使用，也可在-20℃保存數年而不喪失活性。

9.  用比色法估計生物素酰化反應的程度和探針的質量或進行化學發光檢測。