用于基因組測序及足跡分析的連接介導PCR實驗

0.4μg μL溶于pH 7.5的TE緩沖液的經打斷的基因組DNA

第一鏈合成混合物 含有寡核苷酸引物I 20μmol L單側接頭混合物 連接酶稀釋液 連接酶混合物 2000 ?3000 Weiss 單位 mL T4 噬菌體 DNA 連接酶 用于沉淀的鹽混合物 100%乙醇 冰冷和室溫 75%乙醇 室溫 擴增混合物 含有接頭引物和引物2 2 U μL Vent DNA聚合酶混合物

1.5 mL硅化微量離心管 帶管扣(可選) 4°C和17°C水浴鍋 自動熱循環儀

1) 將5μL (2μg)打斷的基因組DNA加入到一個硅化的1.5 mL微量離心管中，冰水浴放置數分鐘。剪切的DNA樣品必須干凈，如果DNA中混有其他污染物（如哌啶）將干擾反應。從6×10⁵個基因組（3×1O⁵個雙倍體細胞核）出發可得到高質量、重復性好的足跡分析及測序反應。這相當于2μg小鼠（哺乳動物）基因組DNA。對于其他的物種，一般單倍體基因組數至少為6 ×10⁵,但是不同的基因組大小會導致相對應的DNA絕對量不同。

2) 準備含引物I的第一鏈合成混合物，并于冰水浴上冷卻數分鐘。25μLDNA樣品中，用移液器輕輕混勻，將樣品再置于冰水浴中，樣品管加上管扣以防在加熱變性時管子爆開。

3) 將DNA在95℃變性5 min,引物在60℃復性30 min,然后76℃延伸10 min。正在合成第一鏈時，可以按步驟4準備溶液。第一鏈的合成在自動熱循環儀上能很容易地自動進行，也可以手工在不同的水浴間轉移。為了降低背景，應該使復性溫度高于Tm值2℃左右，并且在76℃進行延伸。延伸步驟可以產生一個用于以后連接反應的平端（圖15. 3.1)。

4) 在冰浴上融化20μmol/L的單側接頭混合物。配制連接酶稀釋液，并配制不完整的連接酶混合物，但在步驟6前先不要加入接頭及連接酶，所有液體均放置于冰水浴。

5) 當步驟3中的延伸反應完成時，立即將樣品放至冰浴，4℃稍加旋轉離心以收集冷凝液滴，再置于冰水浴。

6) 將步驟4準備好的不完整連接酶混合物中加入連接酶，混勻；再加入接頭，混勻；放置于冰水浴。

7) 往樣品中加入20μL配制的連接酶稀釋液，用移液器輕輕混勻，放置于冰水浴。加入25μL步驟6準備好的連接酶混合物，用移液器輕輕混勻，再放置于冰水浴上。4℃稍加旋轉離心，17℃水浴過夜。

8) 樣品置于冰水浴數分鐘，4℃稍加旋轉離心，再置于冰水浴。

9) 準備好沉淀鹽溶液。往樣品中加入9.4μL用于沉淀的鹽混合物和220μL預冷的100%乙醇，顛倒混勻，-20℃下至少放置2 h。

10) 4℃離心15 min沉淀連接反應物，棄上清。

11) 加入500μL 75%室溫乙醇顛倒幾次清洗管壁及沉淀，室溫下離心5 min,棄上清。 用移液器吸去痕量乙醇液滴，晾干或者用Speedvac真空旋轉蒸發器蒸發殘存的乙醇。

12) 加入70μL水并將樣品置于室溫以溶解沉淀，偶爾在渦旋混合器上振蕩以促進溶 解。每次振蕩完畢，可離心2?3 s，以收集液滴。當沉淀溶解之后（通常<30 min),將樣品置于冰水浴上冷卻。當溶解沉淀的時候，可以準備和預冷含有 接頭引物和引物2的擴增反應液。

13) 往樣品中加入30μL預冷的擴增反應液，用移液器輕輕混勻。樣品再置于冰水浴。

14) 往樣品中加入3 μL (1 U) Vent DNA聚合酶混合物，用移液器小心混勻。將樣品再置于冰水浴。該反應對所用的Vent DNA聚合酶的用量十分敏感，過量的聚合酶會導致很高的背景。

15) 加入90μL 礦物油覆蓋樣品，4℃稍加旋轉離心，將樣品再置于冰水浴。

16) 進行18個PCR循環。第一步變性應為95℃ 3?4 min,隨后的變性反應可為

1 min；引物復性溫度應高于Tm值0?2℃ (如果引物2和接頭引物：Tm值不同，取較低的Tm值）；76℃延伸3 min,每個循環的延伸步驟另補加5 s；最后一步延伸 10 min。反應完畢，將樣品置于冰水浴，取下管扣（如果使用的話)，4℃稍加旋轉離心，收集冷凝液滴。將樣品置于冰水浴。

本步驟中最重要的參數就是變性溫度。如果溫度太低就會發現沒有信號或序列梯度縮短，如果溫度太高就會使聚合酶失活。

17) 準備含有標記引物3的末端標記混合物，置于冰水浴中預冷數分鐘。取5μL加入樣品中，用移液器溫和混勻水相時，樣品管應盡可能多地置于冰水浴中，4℃稍加旋轉離心，再置于冰水浴

注意：標記混合物含相當大量的32P，操作和棄置樣品及混合物時應格外小心。

18) 進行兩輪PCR以標記DNA。第I次變性反應為95℃ 3?4 min；第2次變性為 95℃1 min。末端標記引物3的復性溫度應高于其計算的Tm值0?2℃，復性2 min；76℃延伸10 min。當第2個延伸反應結束時，將樣品放置于冰水浴。

19) 將樣品置于室溫，然后迅速加入295μL VentDNA聚合酶終止液，在渦旋混合器上振蕩混合，稍加旋轉離心，以收集粘在管壁和頂部的放射性液滴。加入500μL 酚/氯仿/異戊醇，用力搖勻或振蕩混合。室溫離心3?5 min。將上層水相（約 400μL,避免混入界面物質）轉移到一個干凈的經硅化的1.5 mL微量離心管中， 充分混勻，稍加旋轉離心，收集管壁上的液滴。

20) 準備4個干凈的經硅化的1.5 mL微量離心管，每管中加入235μL室溫100%乙醇 和94μL水相，在渦旋混合器上振蕩以充分混勻。-20℃放置至少2 h。棄去所有剩下的水相。

21) 將沉淀樣品在4℃離心15 min，棄上清。

22) 加入500μL室溫75%乙醇，在渦旋混合器上振蕩。樣品在室溫離心5 min,棄上清。用移液器吸去痕量乙醇，然后晾干或用Speedvac蒸化器蒸發殘余的乙醇。

23) 每管中加入7μL加樣緩沖液，室溫放置，偶爾在渦旋混合器上振蕩以幫助溶解沉淀，每次振蕩后，可稍加旋轉離心2?3 s，以收集管壁上的液滴。樣品一般很快就溶解（5 min以內）。可用一根吸管從中吸出液體檢査樣品是否已完全重懸，并用蓋革計數器確定放射性是在樣品里而不是留在管里，將樣品再放回原管。如果仍有大于總放射量的10%留在管里，振蕩，離心，重復上述操作。

24) 將樣品在85?90℃變性5 min后，將每管中全部樣品加樣于6%測序膠上進行電泳，電泳完畢固定并干燥膠，然后不加增感屏放射自顯影6?24 h。因為加入了 25 bp的接頭，測序梯級應比原始的足跡或測序產物長25 bp。

本節中所有使用的試劑都應該是新鮮配制的高純度試劑，而且所有的溶液均需用在玻璃蒸發器中獲得的蒸餾水配制。

其他試劑：

礦物油，末端標記混合物 含有末端標記的引物3 ，Vent DNA聚合酶終止液 25:24:1 (V/V/V)酚/氯仿/異戊醇，加樣緩沖液