用于基因組測序及足跡分析的連接介導PCR實驗2

DNA

PBS適用于樣品細胞的培養液裂解液在15 cm培養血的單層培養細胞雙份樣品100%硫酸二甲酯（DMS)緩沖液平衡酚25:24:1 (V V V)酚 氯仿 異戊醇24: 1(V V)氯仿 異戊醇

50 mL和15 mL一次性使用的螺口聚丙稀管（如Corning)帶廢液瓶的抽氣裝置一次性細胞刮子臺式離心機（如IEC Centra-7R)1.5 mL硅化的微量離心管帶管扣封堵的巴斯德吸管或細玻璃棒

1) 在實驗前先準備好以下溶液：在置于通風櫥的37℃水浴中預熱的PBS(約75 mL/ 15 cm培養皿）；將每份24 mL細胞培養液加入到50 mL的一次性使用螺口聚丙烯管中，與PBS—樣在37℃水浴預熱。配制裂解液。

2) 對于對照（未處理的）細胞：棄去15 cm組織培養皿中的培養液，迅速加入約25 mL 預熱的PBS，輕輕晃動幾次，倒掉PBS。立即進行步驟5。

3) 對于體內DMS處理細胞：棄去15 cm組織培養皿中的細胞培養液。取24μL 100% DMS加至每份預熱的培養液中（DMS終濃度0.1%)，旋上蓋子，倒轉幾次以混勻，然后將全部液體加入到組織培養皿中，讓含0.1 % DMS的培養液與細胞接觸恰好 2 min。

臨用前才加入DMS,培養液中的水會很快使之失活。可通過調整溫育的時間和（或）DMS的濃度，以得到最適的DMS足跡。

4) 用帶廢液瓶的抽氣裝置，吸出并棄去含0.1% DMS的培養液。輕輕地加入約25 mL 預熱的PBS于細胞培養皿中，輕輕混合幾次，然后吸去PBS。用預熱的PBS如此反復洗培養皿3次，每次PBS在細胞上應停留30 s左右。

5) 對于處理的和未處理的細胞：盡量吸盡PBS,然后加入1.5 mL裂解液，輕輕搖動使裂解液均勻地布滿整個細胞層的表面，室溫放置約5 min。

6) 傾斜培養皿，然后用一次性細胞刮子將DNA細胞裂解液刮下，用吸管盡可能將裂解物全部轉移至1個15 mL聚丙烯管中。

7) 細胞裂解液在37℃溫育3?5 h,每隔30?60 min混合1次。溫育過程中，用蛋白酶K消化細胞蛋白質。結束溫育后，樣品可在-20℃無限期儲存，在使用之前應先融化并使其溫度至室溫。

8) 加入1.25倍體積的緩沖液平衡酚，輕輕顛倒30次充分混勻。在臺式離心機上室溫 1300 g (在 IEC Centra-7R 離心機上為 2500 r/min)離心 10 min。用23 cm 的巴斯德吸管穿過水相和界面插至管底，吸去底層的酚。如果黏性的DNA被帶至有機相，可用吸頭吹出空氣氣泡而使其分離。不要觸動界面，因為在界面處有許多DNA。用酚重復抽提1次。

9) 加入1倍體積酚/氯仿/異戊醇，輕輕顛倒約30次充分混勻。室溫500 g (在IEC Centra-7R離心機上為1500 r/min)離心10 min,如步驟8用23 cm的巴斯德吸管頭從底部吸走酚/氯仿/異戊醇。勿觸動界面，重復此抽提步驟1次。

10) 加入1倍體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒約30次充分混勻。室溫200 g離心5 min, 如步驟8用巴斯德吸管從底部吸走氯仿/異戊醇溶液。

11) 加入1倍體積乙醚，輕輕顛倒約30次重復混勻。通過重力作用使其分層（約 1 min),用一根巴斯德吸管吸取乙醚（上相），在通風櫥中使所有殘余的乙醚完全 揮發（約5 min)。

12) 加入1倍體積異丙醇，輕輕顛倒約30次使其混合完全。

13) 將纖維狀的DNA沉淀纏繞在已封堵的23 cm長的巴斯德吸管上或細玻璃棒上，小心地從異丙醇溶液帶出，將DNA輕壓試管內壁使多余液體流去。

14) 將纏繞著的DNA置于3 mL pH 7.5的TE緩沖液，室溫下輕輕搖數小時至過夜使 DNA重新溶解。

15) 加入330μL 3 mol/L乙酸鈉和6.7 mL冰冷的100%乙醇，輕輕顛倒約30次充分混勻。如步驟12和13，重新沉淀和纏起DNA。

16) 將纏繞著的DNA置于200?500μL pH 7.5的TE緩沖液，室溫放置過夜或4℃放置數天，在此過程中不時地輕輕顛倒幾次，使DNA重新溶解。溶解完全后，用分光光度計測定DNA濃度，并將其濃度調為0.5?1 mg/mL，儲于4℃。對照DNA (沒有用DMS處理）質量應較高，此時可用于基因組測序和基因組甲基胞嘧啶分析（Garrity and Wold，1992)。

17) 將約75?175μL對照DNA加入到一個硅化的1.5 mL微量離心管中，加入TE緩沖液至175μL

18) 在495μLH2O中加入5μL100% DMS得到1% DMS溶液,振蕩25 s充分混勻， 稍加旋轉離心，收集液滴。DMS應試幾個不同的濃度，以確定與用于步驟3和4的體內條件最為匹配的條件。

19) 加入25μL1% DMS溶液于對照DNA中，輕輕顛倒約25 s充分混勻。避免DMS 溶液粘在管蓋上，如有黏附，可稍加旋轉離心。室溫溫育恰好2 min,然后加入50 μL冰冷的DMS終止緩沖液。立即加入750μL在干冰上預冷的100%乙醇，劇烈搖動使其混合，將管子插入碎干冰中，讓樣品在干冰上放置約30 min。

20) 與體外DMS處理的樣品平行，制備經體內處理的DNA待哌啶處理。將200μL DNA (來自步驟16)與50 冰冷的DMS終止緩沖液混合，在渦旋混合器上稍加振蕩（3 s)。加入750μL冰冷的100%乙醇，劇烈搖動混合。將管子插入干冰中，讓樣品在干冰上放置約30 min。

21) 將兩種DNA沉淀樣品（來自步驟19和20)4℃離心l0 min，棄上清。將沉淀加入1 mL室溫的75%乙醇，在渦旋混合器上稍加振蕩（5 s)直至沉淀離開管壁。4℃離心10 min,棄上清。

22) 用水按1:10稀釋哌啶至終濃度為1 mol/L，往每種DNA沉淀中加入200μL。室溫下溫育以重溶DNA，并間或在渦旋混合器上振蕩。沉淀通常可在15 min左右溶解。仔細檢查樣品確定DNA已完全溶解，沒有溶解的沉淀在1 mol/L的哌啶中會形成小透鏡狀的清晰漂浮物。注意：應在通風櫥中分裝哌啶。

23) 當沉淀已完全溶解，稍加旋轉離心以收集液滴。扣上管扣，在通風櫥中于90℃加熱 30 min。用哌啶加熱處理可以使基因組DNA在甲基化的鳥嘌呤處斷裂，使DNA變性并破壞污染的RNA。

24) 打開管扣，稍加離心以收集冷凝液滴。置樣品于干冰上冷卻10 min。用Speedvac 真空旋轉蒸發器在室溫蒸發1?2 h,除去哌啶。

25) 沉淀用360μL pH 7.5的TE緩沖液重懸。加入40μL 3 mol/L pH 7.0的乙酸鈉，在渦旋混合器上振蕩混勻；加入1 mL冰冷的100%乙醇，劇烈搖動以充分混勻，-20℃至少放置2 h以上。

26) 樣品在4℃離心15 min，棄上清。沉淀用pH 7.5的TE緩沖液500μL重懸，加入 170μL 8 mol/L乙酸銨，在渦旋混合器上振蕩混勻；加入670μL異丙醇，劇烈搖動以充分混勻，-20℃放置至少2 h。

27) 樣品在4℃離心15 min,棄上清。加入500μL室溫的75%乙醇，在渦旋混合器上 振蕩，樣品在4℃離心15 min，棄上清，并用吸管吸去殘余的痕量乙醇。

28) 沉淀用50μL水重懸，然后在Speedvac蒸發器中干燥1 h。重新溶解沉淀于TE緩沖液中，使DNA終濃度約為1μg/mL。

29) 樣品在室溫離10 min,將上清液轉移至一個新的經硅化的微量離心管中，如有膠狀沉淀存在，棄去。用分光光度計對DNA定量，并用pH 7.5的TE緩沖液將濃度調至0.4μg/μL,此時的樣品可用于連接介導PCR。

其他試劑：

乙醚，異丙醇，TE緩沖液，pH 7.5 ，3 mol/L 乙酸鈉，pH 7.0，100%乙醇，室溫或干冰冷卻，75%乙醇，室溫，冰冷的DMS終止緩沖液，哌啶，8 mol/L乙酸銨