一、設計具有標簽的蛋白質時需要考慮的因素親和力和可溶性的選擇在大腸埃布氏菌中生產外源蛋白時面臨兩個挑戰: 一? 是所用蛋白質表達系統的表達水平很低; 二是所表達的蛋白質被錯誤折疊進不溶性的聚集體—包涵體中。弱啟動子、低轉錄起始或稀有密碼子的存在引起的表達問題都可以通過在裝配過表達質粒時將矯正序列（correctivesequence) 引入基因中和使用補充了稀有 tRNA 的大腸桿菌來得到解決。 將高表達的內源性蛋白質融合在外源目標蛋白質的 N 端不僅是一個提高產量的方法，而且還可以增加目標蛋白質的可溶性: 這是可溶性標簽的基本原理。 另外，親和標簽對蛋白質的純化至關重要，它提供了多種策略使目標蛋白質結合在親和基質上 (表 I6.1)。一些蛋白質標簽既可作為親和標簽，又可作為可溶性標簽。例如，谷胱甘肽-S-轉移酶 (glutathione-S-tamsferase，GST) 可以提高某些蛋白質的可溶性，而可溶標簽麥芽糖結合蛋白（maltosebindingprotein,MBP) 也可用于目標蛋白質的親和純化。 標簽的選擇親和標簽和可溶性標簽在分子質量上差別非常大，因此它們給宿主細胞帶來的代謝負擔也有很大不同。例如，對一個具有 100 個氨基酸殘基的融合有 MBP 標簽 (43kDa) 的目標蛋白質來說, 要想獲得 Img 的目標蛋白質就必須表達 5xng 的融合蛋白。親和標簽所要求的純化費用也各不相同，有樹脂本身的成本，也有操作過程中的花費 (再生與再使用的難易、洗脫試劑、結合能力等)。Lichty 等 (2005) 對 8 種親和標簽在純化、產量、成本等多個方面進行了比較。目前, 也已經開展了許多類似的研究，一些綜述對親和標簽 (Arnauetal.，2006b;Waugh，2005) 和可溶性標簽（EspositoandChatterjee，2006) 進行了較好的總結 (Terpe，2003)，并列出了它們的優點和不足。 除去費用因素，選擇哪種親和標簽通常取決于適合目標蛋白質純化的緩沖液。組氨酸標簽不適用于某些對氧化作用和蛋白質水解損傷敏感的蛋白質的純化，因為固相金屬親和色譜（immobilizedmetalaffinitychromatographic，IMAC) 的介質不耐受還原劑或 EDTA。同樣的，使用 IMAC 介質純化對金屬離子敏感的蛋白質時也要非常小心。相反，如果目標蛋白質需要變性環境或需要重折疊，那么組氨酸標簽和 IMAC 純化方法就是很好的選擇。 在一些情況下，表達水平也能決定標簽的選擇—可溶標簽如甘露糖結合蛋白 (mannan-bindingprotein,MBP)、硫氧還原蛋白標簽（thioredoxin,Trx)、N 利用質 A(N-utilizationsubstanceA，NusA) 和谷胱甘肽-S-轉移酶都有很強的翻譯起始信號，能夠驅動高水平的表達，這對于結構研究是非常有用的。另外，當需要低水平表達的時候，如當研究復合物或者生理相互作用的時候, 特異性更強的表位標簽或串聯標簽就是更加合適的選擇。 蛋白酶切割位點來去除。一些具有組氨酸標簽的蛋白質已經實現了結晶，標簽對蛋白質結構的影響很小或完全沒有 (Carsonetal.，20 〇 7)。對某些蛋白質來說, 組氨酸標簽實際上有助于蛋白質晶體的形成 [如 Smits 等 (2008)]。組氨酸標簽也可以與商業來源的該標簽特異性的抗體共同用于蛋白質的檢測。 也有一些非標準的 6X 組氨酸形式的組氨酸標簽。為了降低電荷或增加穩定性，這些標簽的組氨酸序列中散布著別的氨基酸殘基，如 HAT-標簽和 6XHN 標簽，它們能夠更好地結合 Co2+-Talon 樹脂（Clontech 公司）和 MAT 標簽（metalaffinitytag)(SigmaAldrich 公司） GST 標簽GST 是一種表達量很高的 26kDa 的真核蛋白質。研究顯示，當融合在目標蛋白質的 N 端時，克隆自日本血吸蟲 (Sc/iistosomajaponicwm) 的 GST 能夠提高蛋白質的可溶性和表達量（SmithandJohnson,1988)。當 GST 位于 C 端時（圖 16.1B)，其促溶能力相對較弱，但是仍然能夠很好地起到親和標簽的作用。GST 可以與固定在樹脂上的谷胱甘肽 (glutathione) 結合, 這可用于含有 GST 標簽蛋白質的親和純化。融合蛋白結合在樹脂上以后，可以在中性溫和的條件下被游離的還原性谷胱甘肽 (10?40mrnol/L) 洗脫下來。 純化 GST 融合蛋白所用的樹脂，如谷胱甘肽瓊脂糖微球 (glutathione^sepharosebead) 相對來說價格便宜, 而且有很高的載量（5?10 mgGST/mL 樹脂），經過再生后可以多次使用。 要結合谷胱甘肽，GST 標簽必須以正確的折疊形式存在，因此融合蛋白必須是可溶的且在非變性的條件下才能得到有效的純化。GST 融合蛋白的表達量通常都很高，因此必須小心檢測蛋白質的可溶性。對某些蛋白質來說,GST 具有可溶性標簽的功能 [如 Kim 和 Lee(2008)]。GST 的底物 1-氣-2，4-二硝基苯（l-chloro-2，4dinitroben-zene,CDNB) 存在時，可以通過比色法 (c 〇 l 〇 rimetricassay) 對其進行檢測（Habigetal.，1974); 當與樹脂上的谷胱甘肽的結合不理想時，這個實驗也可以用于監測融合蛋白中 GST 的折疊是否正確以及它的親和力。同樣可以用商業化的抗 GST 抗體來檢測這個標簽。 GST 標簽比較大，這使其更容易被蛋白酶降解，因此 GST 融合蛋白的純化應快速進行以使它的損失最小化。與含有組氨酸標簽的蛋白質不同，可以使用含有 EDTA 的緩沖液制備 GST 標簽蛋白樣品以減少蛋白質降解。使用還原條件時一定要小心，因為 GST 有 4 個暴露在溶劑中的半胱氨酸，它們與蛋白質的氧化聚集有關。GST 在溶液中會形成同源二聚體，因此對寡聚蛋白來說，選擇融合 GST 標簽不是一個明智的選擇。 GST 與谷胱甘肽的結合及洗脫都相對較慢，所以 GST 融合蛋白需要以較慢的流速上樣和洗脫。因為谷胱甘肽在 280nm 處有很強的吸收，所以在洗脫時對蛋白質的監測要小心仔細地進行。 其他純化標簽(1) 表位標簽 一些可以被商業來源的抗體識別的短氨基酸序列可以作為檢測和純化蛋白質的標簽使用。在分子生物領域中，添加表位標簽（epitopetag) 作為追蹤重組蛋白的一般做法已被廣泛運用 (FritzeandAnderson,2000)，這種方法有很高的特異性，而且較小的標簽可以將對目標蛋白質結構和功能的影響降到最小。這些標簽通常加在 N 端或 C 端，也可以加在靶蛋白序列中（在環狀結構中或結構域間的暴露于溶劑中的區域）。宿主細胞通常沒有與表位標簽相同的氨基酸序列，這使得對靶蛋白的檢測變得容易。但是，對于純化來說，表位標簽結合的介質價格昂貴 (通常是被固定在色譜層析樹脂上的單抗），與其他親和純化介質相比，不適合大規模的蛋白質制備。標簽對應的短肽、低 PH 或其他方法 (如將標簽結合所需的鈣離子螯合掉，或者用鹽或多元醇) 可以用來洗脫目標蛋白質，但是與其他親和純化的方法相比，它們中的一些方法會顯得比較劇烈 (詳見第 28 章）。 FLAG 標簽是一種只有 8 個氨基酸殘基 (DYKDDDDK) 的親水性短肽標簽，它可以用來進行目標蛋白質的檢測和純化（EinhauerandJungbauer,2001;Prickettetal.，1989)。除了可以利用一些高特異性的抗 FLAG 單抗, 還可以用 FLAG 標簽中所含有的腸激酶 (enterokinase) 酶切位點（DDDK) 在純化后徹底去除標簽。FLAG 標簽的一個變種是 3XFLAG 標簽 (Sigma-Aldrich 公司）, 這種標簽由 3 個串聯重復的 FLAG 樣序列組成 (Hernanetal.，2000)。其他常用的表位標簽包括流感病毒血凝素表位標簽 (influenzahemagglutininepitopetag,HAtag) 和 c~Myc 標簽（FritzeandAnderson,2000)。 (2)S 標簽 Raines 等 (2000) 對 S 標簽進行過綜述，利用了 RNA 酶 SCRNaseS) 的 N 端的 S-肽段 (1?20 位）與 S-蛋白（21?124 位殘基）之間的緊密結合（RichardsandVithayarhil，1959)。S 標簽系統使用了 S-肽段 N 端的 1?15 個氨基酸殘基，還有固定在瓊脂糖微球上的 S-蛋白來純化目標蛋白質。通常來說，具有 S 標簽的載體編碼一個位點特異性的蛋白酶切割位點，可以通過將標簽切掉或更劇烈的變性條件去破壞 S 標簽和 S-蛋白之間的相互作用來進行蛋白質的洗脫。 (3)STREP-n 標簽 STREP-II 標簽 (WSHPQFEK) 利用了生物素（biotin) 與鏈親和素（streptavidin) 之間強大的特異性相互作用（SchmidtandSkerm,1994)。這個肽標簽結合在鏈親和素的生物素口袋位置。Strep-Tactin 是經過了優化的能夠結合 STREP-II 標簽的重組鏈親和素，已經用于親和介質的制備。結合的目標蛋白質能夠被較低水平 (2.5 mmol/L) 的脫硫生物素（desthiobiotin) 洗脫下來，脫硫生物素是一種生物素類似物，它能夠以可逆的方式競爭性結合 Strep-Tactin(SkerraandSchmidt,2000)。洗脫條件比較溫和，所用緩沖液能夠含有高濃度 (達到 50 mmol/L) 的還原劑 (如 DTT 或者 i9■疏基乙醇），也能夠含有螯合劑 (如 EDTA), 對于那些對氧化劑敏感的蛋白質來說，STREP-II 標簽是一種極好的純化方法。Strep-Tactin 層析法的樹脂能夠再生，可以反復利用數次。雖然大多數細胞提取物都含有少量的天然生物素化的宿主蛋白（biotinylatedprotem)，它們通常不會對純化造成干擾，但是如果有必要, 可以在宿主蛋白中加人親和素以除去生物素化的宿主蛋白（SchmidtandSkerra，2007)。也有一些研究嘗試使用鏈親和素/親和素 (streptavidin/avidin) 作為融合標簽，但是這些標簽很難用于親和純化，因為這些蛋白質之間的相互作用太強以至于很難被破壞掉。 (4)CBP 標簽 鈣調蛋白結合肽（calmodulin-bindingpeptide,CBP) 是一種具有 26 個氨基酸殘基的短肽。它來源于骨務肌肌球蛋白輕鏈激酶 (skeletalmusclemyosinUghtchainkinase) 的 C 端，能夠特異性地結合轉調蛋白 [參考 Terpe(2003)]。固定在層析介質上的鈣調蛋白（如鈣調蛋白-瓊脂糖凝膠）能夠用來純化具有 CBP 標簽的目標蛋白質。 盡管鈣調蛋白與 CBP 結合得非常緊密（親和力在納摩爾級），但是這種作用依賴于鈣離子，結合的蛋白質可以用含有鈣離子螯合劑的溫和緩沖液 (如 EGTA)—步洗脫下來。因為 CBP 標簽包含有蛋白激酶 A(proteinkinaseA) 的靶序列, 所以該標簽的另一種用途是對融合蛋白進行 32P 同位素標記（Vaillancourtetal.,2000)。因為在真核細胞中很多內源性蛋白質能夠與鈣調蛋白產生互相作用，所以 CBP 標簽不適用于真核表達系統。 二、可溶性標簽在重組蛋白表達中，特別是當在細菌中表達真核蛋白時，主要的瓶頸在于蛋白質的正確折疊與可溶性。一些可溶性蛋白已被作為標簽用來改善目標蛋白質的折疊。這些標簽應該與其他方法共同使用來促進蛋白質的折疊，如誘導后降低培養溫度或者共表達伴侶蛋白（BaneyxandMujacic,2004;deMarcoetal.,2007;Sahdevetal.，2008)，為了獲得較高可溶性的目標蛋白質，有必要嘗試多種可溶性標簽 (PelegandUnger,2008)。對于那些特別難溶的蛋白質來說，可以嘗試在變性的條件下純化蛋白質，然后再進行重折疊 (CabritaandBottomley，2004;JungbauerandKaar，2007;Qoronflehetal.，2007; 詳見第 17 章)。 MBP 標簽因為 MBP 標簽能夠特異性地結合麥芽糖 (maltose) 和直鏈淀粉 (atnylose)，所以它不僅可作為一種可溶性標簽 (diGmmetal,,1988)，而且能夠有效地用于親和純化。MBP 是一個 43kDa 的大腸桿菌分泌型蛋白，它的表達水平很高并且能夠提高融合在其 C 端的蛋白質的可溶性 (KapustandWaugh,1999)。近期的研究顯示，融合在目標蛋白質 C 端的 MBP 也同樣有效（Dysonetal.，2004)。MBP 很大，這給細胞的代謝帶來很大負擔，但一個高通量的測試顯示，MBP 標簽是最好的可溶性標簽之一（DysonetaU2004;Kataevaetal.，2005)。但是, 大約有 1/4 的 MBP 融合蛋白依然是不溶的，或者在去除了 MBP 標簽后蛋白質變得易于聚集^例如，我們使用大腸桿菌表達人降鈣素基因相關肽受體組分蛋白（humancalcitoningene-relatedpeptide-receptorcomponentprotein,CGRP-RCP) 時發現，通過腸激酶酶切去除 N 端的 MBP 標簽后出現了目標蛋白質的聚集，雖然該蛋白質已經得到了成功的表達和純化 (Tolunetal.，2007)。每種可溶性標簽的促溶效果是不同的，對于那些難溶蛋白質來說，需要嘗試多種標簽。硫氧還蛋白標簽對于 CGRP-RCP 的表達是無效的，目標蛋白質仍然不溶。Nallamsetty 和 Waugh(2006) 認為，可溶性標簽 (如 MBP 或 NusA) 在目標蛋白質的折疊中提供了幫助，去除標簽后那些易聚集的目標蛋白質的可溶性由該蛋白質的自身性質決定，而不是所用的標簽。 含有 MBP 標簽的商業化載體具有多種標簽去除位點 (NewEnglandBiolabs 公司），可以用于在胞質和周質中表達目標蛋白質。交聯直鏈淀粉 (cross-linkedamylose) 樹脂可以用來結合具有 MBP 標簽的蛋白質，結合的融合蛋白能夠很容易地被含有 10 mm01/1-麥芽糖的洗脫緩沖液洗脫下來。這使得具有 MBP 標簽的蛋白質可以在溫和的環境中經過簡單的一步得到純化。然而，淀粉親和純化法不能夠在有還原劑或者變性環境中進行。 淀粉樹脂會在一定程度上被粗提物中的淀粉酶降解，尤其是生長在豐富 LB 培養基的細胞的提取物，通過在培養基中加人葡萄糖 (〇.2%), 這種作用可以被降到最低。淀粉樹脂可被再生并重復使用多次。 硫氧還蛋白標簽硫氧還蛋白（thi 〇 red 〇 xin，TrX) 是一種熱穩定的、12kDa 大小的大腸桿菌胞內蛋白，該蛋白質很容易過表達，而且即使過表達至細胞總蛋白質的 40% 以上也仍然是可溶的 (LaVallieetal.，1993)，因此在重組蛋白制備中可以將其用做可溶性標簽來避免包涵體的形成（LaVallieetaL,2000)。Dyson 等（2004) 的實驗結果顯示，Trx 標簽加在目標蛋白質的 N 端可以發揮更好的作用。 硫氧還蛋白會積聚在細胞質膜的黏附位點上（BayeretaL,W87)，這使得 Tnc 融合蛋白能夠經簡單的滲透壓或凍融處理釋放出來，這提供了一種簡單的初步純化。通常會在 Tnc 標簽外再添加另外的親和標簽，如組氨酸標簽，以進行進一步的純化。 NusA 標簽N 利用物質 A 轉錄抗終止因子（iV-utilizingsubstanceAtranscriptionantiterminationfactor，NusA) 是一個具有 495 個氨基酸殘基的大蛋白質，根據一個可溶性統計模型 (statisticalsolubilitymodel)，與外源蛋白融合表達時，NusA 是大腸桿菌蛋白中可溶性最好的，這是選擇其作為可溶性標簽的原因（Davisetal.，1999;DeMarcoetaL，2004)。 在一些高通量的篩選測試中，NusA 作為可溶標簽與 MBP 效果相似甚至好于 MBP 標簽。 但是，對不同蛋白質來說會有不同的結果。NusA 標簽通常與其他親和標簽一起使用，如組氨酸標簽。 其他可溶性標簽目前，已經研發了一些比較小的溶解性增強標簽（solubilityenhancementtag，SET) 或者溶解性增強肽 (solubilityenhancementpeptide，SEP) 標簽，這些標簽利用高度酸性序列來增強某些目標蛋白質的可溶性 (KatoetaL，2007;ZhangetaL，2004)。其他的一些小標簽有 GBl 標簽 (56 個氨基酸殘基），該標簽基于鏈球菌蛋白 G(streptococcalproteinG) 的 IgG 結合 BI 結構域 (ChengandPatel，2004;Zhouetal.，2001) 還有蛋白 A 的 IgG 結合結構域 (ZZ 結構域，116 個氨基酸殘基；InouyeandSahara，2009;Rondahletal.，1992)。這些比較小的標簽對制備用于核磁共振（NMR) 研究的蛋白質樣品尤其有用 (KatoetaL，20 〇 7)。另夕卜，在使用蛋白質連接法 (proteinligationmethod) 創建 NMR 不可見的可溶性標簽方面也取得了一些進展（Durstetal.，2008;Kobashigawaetal.，2009) 〇研究顯示，融合在目標蛋白質 N 端較小的泛素樣修飾物 (smallubiquitin-likemodifi?er，SUMO) 蛋白 (大約 11kDa) 能夠極大地提高目標蛋白質的穩定性和可溶性（Marblestoneetal.，2006)。在目標蛋白質純化完成后，可用識別 SUMO 結構的 SUMO 蛋白酶 (Ulpl 的催化結構域）去除該標簽（Leeetal.，2008;Panavasetal.,2009)。SUMO 融合系統也已經通過改造用于昆蟲細胞和其他真核表達系統（Liuetal.,2008)。 Halo 標簽是最近構建的模塊化標簽系統（modulartaggingsystem), 該系統具有一個大小為 34kDa 的、經過改造的鹵代燒脫鹵素酶 (haloalkanedehalogenase) 蛋白，它可以結合多種合成的配基（HaloTag 配基；Promega 公司）。這些配基的成分包括一個與 Halo 標簽共價結合的恒定的反應性接頭和一個可變的報告末端，該末端能夠賦予融合蛋白許多有用的性質。因此，單一的標簽可以用于活細胞的亞細胞結構成像、細胞標記和分類、親和純化及固相支持物上的固定（Losetal.，2008)。Ohana 等（20 〇 9) 使用了一個此類標簽（HaloTag7) 與附著在瓊脂糖微球上的氯燒烴接頭（chloroalkanelinker) 進行了親和純化。因為 Halo 標簽能夠以一種高度特異的不可逆的方式與接頭共價結合, 所以即使極低表達量的蛋白質也能夠高效地結合在氯烷烴樹脂上。可以使用煙草蝕紋病毒蛋白酶 (tobaccoetchvirusprotease,TEV) 將目標蛋白質洗脫下來，該酶可以切割位于 Halo 標簽和靶蛋白之間的切割位點。令人驚訝的是，使用一組在大腸桿菌中難以表達的重組蛋白進行的測試表明，這種緊湊的單體 Halo 標簽可以顯著地提高融合蛋白的可溶性 (OhanaetaL，2009)。在這些實驗中，Halo 標簽的表現要大大好于 MBP，確實顯示出了可溶性標簽的功能。 展開 | 