用于PCR的模板DNA制備實驗——含血標本

1. 3 ml 外周血或 1 ml 骨髓液放入含 50 μl 0.5mol/L EDTA 的無菌離心管（15 ml 管）中。

2. 2000 r/min 離心 10 min。吸去血漿，用指彈勻剩余的有核細胞和紅細胞，加入紅細胞溶解液 10 ml 并混勻，常溫下放置 30 min。紅細胞溶解液配制：NH₄Cl 4 g，NH₄ClO₄ 3 g，NH₄HCO₃ 0.04 g，加水定容至 1L；滅菌；4℃ 下保存。

3. 2000 r/min 離心 2 min，此時有核細胞成白色團塊沉淀于管底。倒出已溶解的紅細胞液體，然后用少許紅細胞溶解液輕輕清洗剩余紅細胞液體并倒出。

4. 用指彈勻沉淀的有核細胞團塊，加入 3 ml 組織裂解液并彈勻，37℃ 下放置 30 min 以上。骨髓標本中若含有組織塊，可加入 10 μl 蛋白酶 K 以助裂解。

5. 無菌尖頭刀片刮下，放入 300～900 μl 組織裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55℃ 3 h 以上。

6. 其間用指輕彈離心管以利裂解。若有沉淀，再加入 5～10 μl 蛋白酶 K，直至無沉淀已澄清為止。

7. 滅活蛋白酶 K 裂解液中含有蛋白酶 K，需放入沸水中 10 min 以滅活蛋白酶 K。

8. 沉淀蛋白質按裂解液量的 1/3 加入蛋白質沉淀液（飽和乙酸鈉）并混勻，14500r/mm 離心 15 min。此時，蛋白質沉于管底，DNA 溶解于上清液中。

9. 析出 DNA 取上清液并加入等量冷異丙醇，充分混勻，新鮮標本此時可見 DNA 絲纏繞成團析出。若新鮮標本童太少或固定組織因 DNA 片段較小，無法用肉眼見到 DNA 成團析出，需 14500 r/min 再離心 10 min，一般 DNA 可見于管底。