| 實驗步驟 |
材料
緩沖液與溶液
10x 擴增緩沖液
緩沖液中含有 0.01%(m/V) 的明膠
ATP(10 mmol/L)
2X 雜交液
1.5mol/L NaCl
40 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH7.2)
10 mmol/L EDTA(pH6.0)
10xDehardt’s 液
0.2%SDS
NaOH(0.lmol/L)
1X 缺口平移緩沖液
500 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
100 mmol/LMgCl2
50 mmol/LDTT
SDS(10%)
20XSSC
鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液
10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
1mol/LNaCl
Tris-HCl(lmol/L,pH7.5)
酶及緩沖液
DNA 聚合酶/DNaseI(5 單位/ul;Boehringer Mannheim 公司）
限制性內切核酸酶
T4DNA 連接酶
熱穩定 DNA 聚合酶
凝膠
瓊脂糖凝膠（1%),0.5XTBE 配制
見步驟 18.19,24 和 25
核酸與寡核苷酸
含有靶標基因組 DNA 區域的 BACDNA
純化方法見第 4 章方案 8 或 9。
隨機引發制備的平末端 cDNA
見方案 1 階段 1。
Cot1 基因組 DNA
胞漿 poly(A)+RNA, 純化自研究對象組織或細胞系
見方案 1 階段 1。
DNA 分子質量標志物
dNTP 溶液，每種 dNTP 濃度 0.4 mmol/L(pH8.0), 用于缺口平移標記實驗
dNTP 溶液，每種 dNTP 濃度 2.5 mmol/L(pH8.0)，用于 PCR 擴增
寡核苷酸 [10 mmol/L,TE(pH8.0) 配制]
陽性對照 DNA
陽性對照
DNA 須是已知存在于初始基因組 DNA 中的基因或表達序列標簽（EST）的一部分。如沒有已知基因，則在標記之前在基因組 DNA 中（按
1:1 分于比例）加入一段單拷貝對照 DNA，聞時在 cDNA 樣品中加人對照 DNA, 使對照 DNA 與 cDNA 的分子比例為
1:106。應用第 9 章給出的方案之一標記 DNA 樣品；標記方案的選擇取決于實驗目的（關于選擇的討論，參見第 9 章的導言）。
標記化合物
[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol)
Biotin16-dUTP(0.4 mmol)
考用設備
帶濾芯的自動加樣尖頭
蓋革計數器或切倫科夫計數器
預設溫度為 14°C 和 100°C 的加熱裝置
帶旋轉軸的雜交爐，或振蕩水浴
分離鏈霉親和素磁珠的磁性分離裝置
微量離心管（PCR 擴增用 0.5 ml 薄壁管）
帶退尖頭裝置的自動加樣器
SephadexG-50 離心柱，用 TE(pH7.6) 平衡
Steptavidin 包被的順磁珠
可按預設擴增方案進行的熱循環儀
如熱循環儀不帶熱蓋,
則須使用礦物油或封口石蠟以減少 PCR
時反應混合物的液體蒸發，使用封口石蠟不僅可以防止蒸發，還可在反應餛合物加熱之前保持組分（例如引物和模板）分離，這有助于防止在反應的初始階段引物的非特異結合（見第
8 章信息欄"熱啟動 PCR")。
預設溫度為 65°C 的水浴
附加試劑
本方案步驟 1 所需的試劑列在第 10 章，方案 2。
本方案步驟 2 所需的用于隨機引物起始雙鏈 cDNA 合成或用于從 cDNA 文庫中擴增插入片段的試劑列在方案 1, 階段 1 和 2。
本方案步驟 2 標記所需的試劑列在第 9 章，方案 3、5 和 6。
本方案步驟 19 和 20 所需的試劑列在第 6 章，方案 8 和 10。
方法
帶接頭的 cDNA 庫的制備
1.
按照第 10 章方案 2, 用多聚核苷酸激酶分別對 Ooligo3 和 oligo4 的
5'末端磷酸化進行標記，將標記的兩種互補的寡核苷酸按等分子比例混合（每種約 2ug)，100°C 變性 10 min,
緩慢冷至室溫。這一過程中，兩種寡核苷酸復性形成銜接子。將銜接子的濃度調整為 1ug/ml。
2. 以胞漿 poly(A)RNA 為材料，利用隨機引發制備至少 2ug 的平末端雙鏈 cDNA(見方案 l)。
3. 在一個無菌的 0.5 ml 微量離心管中配置以下連接反應體系：
雙鏈平末端 cDNA(步驟 2) 2ug
寡核苷酸擴增盒混合物 3ul
(1ug/ul，來自步驟 1)
10XT4DNA 連接酶緩沖液 3ul
10 mmol/LATP 3ul
T4DNA 連接酶 (1 單位/ul) 3ul
加 H2O 至 30ul
14°C 溫育 16 h。在 65°C 放置 10 min 滅活 T4DNA 連接酶。
10x 連接反應緩沖液組分已添加 ATP, 則反應混合物中可加入更大體積的載體或外源 DNA。使用商品化的含 ATP 的連接緩沖液，則無須添加 ATP。
4. 用酚: 氯仿抽提連接反應產物，結合 SephadexG-50 離心柱層析對產物進行純化并用常規的乙醇法沉淀 DNA。沉淀干燥后重溶于 10ulTE(pH7.6)。
基因組 DNA 克隆的生物素標記
5. 利用缺口平移法在 BAC 基因組 DNA 克隆中引入生物素化的堿基。在一個無菌的 0.5 ml 微量離心管中配置以下缺口平移反應體系（對每個 BAC 基因組 DNA 分別標記):
純化的 BAC DNA(0.1 mg/ml) 1ul
生物素-16-dUTP(0.04 mmol/L) 1ul
10x 缺口平移緩沖液 2ul
用于缺口平移的 dNTP 溶液（0.4 mmol/L) 1ul
[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol) 1ul
DNA 聚合酶/DNaseI(5 單位/ul) 1ul
加 H2O 至 20ul
4°C 反應 2 h。
6. 對用缺口平移法進行放射性與生物素標記的產物用 Sephadex G-50 離心柱層析進行純化，并用常規的乙醇法沉淀 DNA。沉淀重溶于 10ulTE 并-20°C 保存。
鏈霉親和素磁珠的制備
7. 在一個無菌的 1.5 ml 小離心管中，用 500ul 鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液洗滌 3 mg(300ul) 磁珠三次。每次洗滌后用磁性分離裝置將磁珠從結合緩沖液中取出。洗滌后磁珠重懸于鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液，濃度為 10 mg/ml。
8. 對每一標記反應都取少量產物（步驟 6) 檢測其結合鏈霉親和素包被的磁珠的能力。
在一個無菌的 0.5 ml 微量離心管中配置以下結合反應體系
洗滌后的鏈霉親和素包被的磁珠（步驟 7) 20ul
標記的基因組 DNA 連續片段*（步驟 6) 1ul
鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液 29ul
*將疊連群上分別標記的每個 BAC DNA 等量混合，混合物濃度為10ng/ul。
室溫溫育 15 min, 中間不時溫和混勻。用磁性分離裝置分離磁珠，轉移上清至一個無菌的 0.5 ml 微量離心管中。用蓋革計數器或切倫科夫計數器檢測磁珠和上清中的放射性活度。如結合的同位素與游離的同位素比例大于 8:1, 則進行直接篩選。
如結合的同位素與游離的同位素比例小于 8∶1, 可能表明步驟 5 中的 DNA 不適合標記。可在進行標記前, 對 BACDNA 再次用酚: 氯仿反復抽提并通過 SephadexG-50 離心柱層析純化。
直接篩選（第一輪篩選）
9. 按以下步驟用 C0tlDNA 封閉或 “重復抑制” cDNA 庫（來自步驟 4) 中的重復序列：
a. 在一個無菌的 0.5 ml 微量離心管中配置以下復性反應體系：
帶接頭的 cDNA(步驟 4) 5ul(1ug）
人基因組 C0tlDNA 5ul(1ug）
b. 在反應混合物上方加入低比重礦物油（約 50ul) 防止蒸發，然后 100°C 變性 10 min。冷卻反應體系至 65°C, 向礦物池下加入 10ul 的 2X 雜交液。海和混勻后 65°C 溫育 4 h。
如使用的為 YAC 基因組 DNA 靶標，則 DNA 可能為宿主（酵母）核糖體序列所污染。至少用 100ng 來源于 rRNA 的 cDNA 封閉這些序列（見本方案結尾疑難解答)。
10.
當 cDNA 庫與 C0tlDNA 的雜交完成后，進行第一輪直接篩選。取 5ul(50ng) 來自步驟 6 中生物素標記的 BAC DNA
加在一個新的 0.5 ml 量微量離心管中，在反應液的上方覆蓋一滴礦物油（約 50ul) 防止蒸發。100°C 變性 BAC DNA10 min
后，冷卻反應體系至 65°C。
11. 在無菌的 0.5 ml 微量離心管中配置以下復性反應體系：
生物素際記的 BAC DNA(來自步驟 10) 5ul(50ng)
封閉后的 cDNA(來自步驟 9,1ug 20ul
cDNA 加 1ug C0tlDNA)
2x 雜交液 5ul
溫和混勻，旋轉雜交爐或振蕩水裕 65°C 溫育 54 h 以上。
12. 為進行基因組 DNA 與 cDNA 雜合體的捕獲與洗滌，在無菌的 1.5 ml 微量離心管中加入以下試劑：
洗滌后的鏈霉親和素包被的磁珠 100ul
復性反應混合物（來自步驟 11) 30ul
鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液 100ul
室溫溫育 15 min, 中間偶爾溫和混勻。用磁性分離裝置吸附磁珠，然后移除上淸。
用 1 ml1xSSC/0.1%SDS 在室溫洗滌磁珠兩次，每次 15 min; 然后用 1 ml 0.1xSSC/0.1%SDS 在 65°C 洗滌磁珠三次，每次 15 min。最后一次洗滌后，將磁珠轉移至一新的微量離心管中。
13. 將步驟 12 中雜交在磁珠上的 cDNA 洗脫下來：
a. 加入 100ul 的 0.1mol/LNaOH, 室溫放置 10 min。
b. 加入 100 的 1ml/L Tris-HCl(pH7.5)
c. 將反應混合物通過 Sephadex G-50 離心柱層析進行脫鹽（見附錄 8)
第一輪篩選得到的 cDNA 的擴增
14. 從洗脫下來的 200ul 的 cDNA(步驟 13) 中取三份（1ul、5ul 和 10ul) 分別加入無菌的 0.5 mlPCR 管中。
15. 在每管中各加入以下試劑：
引物 oligo3(10 mmol/L) 5ul
10XPCR 緩沖液 2.5ul
dNTP 溶液（每種 2.5 mmol/L)，PCR 用 2.5ul
Taq DNA 聚合酶（Perkin Elmer 公司，5 單位 ul) 0.2ul
加水至 25ul
按上述配置同時設置兩個對照實驗。陰性對照管加入上述所有試劑，但省略 cDNA 模板。第二個對照中則加入 10ng 初始 cDNA(步驟 4) 作為模板。
16. 如熱循環儀不帶熱蓋，則在反應混合物上方覆蓋一滴（約 50ul) 低比重礦物油以防止蒸發。或者加入石蠟珠以應用熱啟動 PCR。將 PCR 管置于熱循環儀上。
17. 按下表列出的變性、復性和延伸參數進行擴增反應。
18.
用 1% 瓊脂糖凝膠在 0.5XTBE 電泳緩沖液中電泳分析每管中 10% 的 PCR 產物，加入適當大小的 DNA
分子質量標準。用溴化乙啶或 SYBR GOLD 染膠以顯示 DNA, 估計 cDNA 擴增產物的濃度，確定能產生最大置擴增產物應加入的模板
cDNA 濃度。
成功反應的產物可見彌散的 cDNA 擴增片段, 可能帶有一些清晰的條帶。
19. 從每管中取等量擴增產物（每泳道約 0.5ug) 加在第 2 塊 1% 瓊脂糖凝膠上，同樣加入適當大小的 DNA 分子質量標準。同時上樣 0.5 步驟 4 中隨機引發所制備的 cDNA。
20. 將分離開的 DNA 轉移到膜上，通過 Southrn 印跡（第 6 章方案 8) 與放射性標記的陽性對照 cDNA 雜交。
篩選得到的 cDNA 產生的雜交信號應比隨機引發制備的 cDNA(步驟 4) 產生的雜交信號約強 1000 倍以上。
21.—旦陽性對照的富集得到證實，大量擴增以制備至少 1.5ug 的篩選得到的 cDNA。
用酚: 氯仿抽提反應產物，并用標準的乙醇法沉淀 DNA。沉淀干燥后重溶于 7.5ulTE 中（200ug/ml)。
cDNA 直接篩選（第二輪篩選)
按照第一輪篩選的條件進行，使用的 cDNA 是 1ug 第一輪篩選產物，基因組靶標 DNA 用量為 50ng(此例中全長為 500kb)。
22. 按步驟 9 的描述封閉第一輪所篩選 cDNA 中的重復序列（用 1ug 第一輪篩選產物并保留 0.5ug 供后續分析)。
23. 按步驟 9 至 13 進行第二輪篩選。
24. 按步驟 18 用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析第二輪篩選擴增產物，在另一個泳道上樣保留的 0.5ug 第一輪篩選 cDNA 產物，同時上樣 0.5 初始 cDNA。
25. 按步驟 20 用放射性標記的報道探針進行 Southern 印跡分析。
通常此次分析結果將顯示, 從初始 cDNA 到第一輪篩選 cDNA 報道探針的豐度得到極大的提髙，而從第一輪篩選 cDNA 到第二輪篩選 cDNA 報道探針的豐度將得到相對適度的提高（約 10 倍）。
26.—旦陽性對照的富集得到證實，將篩選得到克隆到合適的載體中去。擴增接頭盒上帶有的限制位點有利于將第二輪篩選得到的 cDNA 克隆人噬菌體或質粒載體中。
一個很有用的選擇是使用一種現已商品化的不依賴連接的克隆系統（例如
Life Technologies 公司的 UDG 系統或者 CLONEAMP 公司 pAMP 載體系統)。如使用這些系統之一，則使用
5'經過廷伸修飾的 oligo3 引物 (細則參見生產廠家）。關于這一策略的深入討論，參見信息欄「不依賴于連接的克隆」。
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