實驗方法原理 本方案描述通過與 mRNA 驅動方雜交，繼之以羥基磷灰石層析純化單鏈放射性標記的 cDNA，制備扣除 cDNA 探針。
實驗材料 反轉錄酶反轉錄酶緩沖液驅動方 mRNA模板 mRNA
試劑、試劑盒 乙酸銨DTTEDTA乙醇HCl異丁醇NaOH酚氯仿胎盤 RNA 酶抑制劑SDSSDS EDTA 溶液磷酸鹽緩沖液SPS 緩沖液dNTP 溶液
儀器、耗材 沸水浴冰水浴礦物油Sephadex G-50 柱微量離心管水浴或加熱板
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液與溶液
乙酸銨（10 mol/L)
DTT (1 mol/L)
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
HCl ( 2.5 mol/L)
異丁醇
NaOH ( 3 mol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V）
胎盤 RNA 酶抑制劑（20 單位/μl）
SDS ( 10% m/V)
SDS/EDTA 溶液（30 mmol/L EDTA (pH 8.0)，1.2% SDS）
磷酸鹽緩沖液（2 mol/L，pH 6.8）
SPS 緩沖液（0.12 mol/L（pH 6.8)，0.1% (m/V) SDS）
Tris-Cl ( 1 mol/L，pH 7.4)
2. 酶與緩沖液
反轉錄酶
10X 反轉錄酶緩沖液
3. 核酸與寡核苷酸
dCTP ( 125 μmol/L)
含 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液
驅動方 mRNA
oligo (dT)12-18
模板 mRNA
4. 放射性化合物
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性為 >3000 Ci/mmol)
5. 專用設備
在 60℃ 下用羥基磷灰石層析分離單鏈和雙鏈核酸的裝置
沸水浴
冰水浴
礦物油，尖部拉長的可接到自動進樣器上的吸頭，或硅化的一次性 20 μl 玻璃毛細管、銼刀或鉆石刀
Sephadex G-50 柱（5 ml)，用 TE ( pH 8.0）平衡
Sephadex G-50 離心柱，用含 0.1% SDS 的 TE ( pH 8.0）平衡
硅化的微量離心管（1.5 ml）
預熱至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加熱板
二、方法
1. 將 5~10 μg poIy(A)+ RNA 轉移到一個滅菌的微量離心管，用無 RNA 酶的水將 poIy(A)+ RNA 的體積調至 40 μl。蓋緊管蓋，70℃ 加熱 5 min，然后迅速將微量管移至冰水浴。
2. 向冷卻的微量管中加入：
0.1 mol/L DTT 2.5 μl
胎盤 RNA 酶抑制劑 200 單位
oligo (dT)12-18 10 μl
10X 反轉錄緩沖液 25 μl
20 mmol/L dGTP、dATP、dTTP 溶液 10 μl
125 μmol/L dCTP 10 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP
( 比活性為 > 3000 Ci/mmol) 100 μl
無 RNA 酶的水 加至 240 μl
反轉錄酶（2000 單位） 10 μl
輕敲管外壁以混合各組分，微量離心機內稍加離心以收集管底的反應混合物，45℃ 下溫育反應 1 h。
3. 加入以下試劑以終止反應：
0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 10 μl
10% (m/V) SDS 10 μl
'混勻管中的試劑。
4. 向反應管中加入 30 μl 3 mol/L NaOH。于 68℃ 溫育反應混合物 30 min 以水解 RNA。
5. 冷卻反應混合物至室溫，加入 100 μl 1 mol/L Tris-Cl (pH 7.4) 中和溶液，混勻，然后加 30 μl 2.5 mol/L HCl。在 pH 紙上點一小滴（< 1 μl）溶液檢測其 pH。
6. 用酚：氯仿抽提純化 cDNA。
7. 用 TCA 沉淀法或 DE-81 濾膜結合法檢測放射性標記的 dNTP 摻入的比例。按以下公式計算 cDNA 的產率：
在含 1.5 nmol 限量 dNTP 的反應中：
8. 通過 5 ml Sephadex G-50 柱層析分離放射性標記的探針與未摻人的 dNTP。
9. 在放射性標記的 cDNA 中，加入 10 倍重量的驅動方 RNA，用來扣除 cDNA 探針，并加入 0.2 體積的 10 mol/L 乙酸銨和 2.5 體積的冰冷乙醇。于 0℃ 放置 10~15 min，然后在微量離心機中以最大速度在 4℃ 下離心 5 min 回收核酸。
10. 吸去所有的乙醇，敞開管蓋，置于試驗臺上使剩余的乙醇蒸發。將核酸溶于 6 μl 無 RNA 酶的水中。
11. 在溶解的核酸中加入：
2 mol/L 磷酸鈉（pH 6.8) 2 μl
SDS/EDTA 溶液 2 μl
12. 用一滴輕礦物油覆蓋于溶液上或將混合物吸入硅化的一次性 20 μl 玻璃毛細管，并在本生燈火焰上封住毛細管兩端。
13. 將微量離心管或封口的毛細管放入沸水浴中 5 min，再移至 68℃ 水浴雜交，直至 Cr0t = 1000 mol·s/L。
14. 從水浴中取出微量離心管或毛細管。用一個尖部拉長的吸頭連到微量進樣器上，從微量離心管中吸出雜交液，或用銼或鉆石筆打開毛細管的一端，將雜交反應液轉移到含有 1 ml SPS 緩沖液的管中。
15. 在 60℃ 下通過羥基磷灰石層析分離單鏈和雙鏈核酸。
16. 合并含單鏈 cDNA 的各組分，用異丁醇反復抽提濃縮：加等量異丁醇，漩渦振蕩混勻兩相，室溫下以最大速度在微量離心機中離心 2 min，棄上（有機）相。反復用異丁醇抽提，直到水相體積 <100 μl。
17. 通過以含 0.1% SDS 的 TE ( pH 8.0) 平衡的 Sephadex G-50 離心柱層析，去除 cDNA 中的鹽。
18. 檢測樣品中的放射性量，計算扣除探針中 DNA 的重量。
19. 重復步驟 9~18。
10%~30% 的 cDNA 將在第二輪雜交中與驅動方 RNA 形成雜交體。