用尼龍毛法分離B細胞方法步驟

<sub>一、尼龍毛柱的制備

1.取直接3D，長度約10cm的尼龍毛，用0.2mol/L HCl浸泡處理過夜。用雙蒸水洗凈HCl，置37℃烘干備用。

2.稱取50mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夾住。將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高約 5～6cm。此柱可分離約2×107細胞。將柱置－20℃可保存2～3個月。

二、分離細胞

1.取分離的單個核細胞，用細胞培養液將細胞配成2×107/0.5ml。

2.融化尼龍毛柱，以每分鐘5～7滴的速度放出Hanks液，并用5ml預溫至37℃的細胞培養液洗滌尼龍毛柱。小心將細胞懸液加入尼龍毛柱中，待細胞懸液全部進入尼龍毛柱后，立即加0.2ml細胞培養液，夾住塑料管。

3.在37℃ 5％ CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中靜置1小時。用5ml預溫至37℃的細胞培養液洗脫細胞。洗脫液中含有純的T細胞。再用5ml預溫至37℃的細胞培養液洗滌尼龍毛柱，洗凈不粘附的細胞。</sub>

4.加入0.5ml細胞培養液，夾住塑料管，將尼龍毛柱置冰箱中冷卻。用4℃預冷的細胞培養液分3～4次洗脫尼龍毛柱，每次0.5ml。可先夾住塑料管，用玻璃棒或金屬絲反復擠壓尼龍毛以利粘附細胞脫落，然后再洗脫。洗脫液中含有大量B細胞。離心1000×g 10分鐘，去上清液，用細胞培養液同樣洗滌胞1次。計數細胞，用細胞培養液將細胞配成適當濃度。