試劑、試劑盒 緩沖液、溶液和試劑酶和酶緩沖液核酸和寡核苷酸
儀器、耗材 特殊設備
實驗步驟
第 1 階段：降解 RNA 的去磷酸化
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
乙酸鈉，3mol/L,pH5.2
乙醇
二硫蘇糖醇（DTT)（0.1mol/L)
苯酚/氯仿（1:1，體積比）
2. 酶和酶緩沖液
磷酸酶緩沖液，10X
蛋白酶 K
RNasin
牛小腸堿性磷酸酶（CIP)
3. 核酸和寡核苷酸
RNA 樣品
4. 特殊設備
預設為 37°C、50°C 的水浴或加熱儀
5. 其他
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包括溴化乙錠
二、方法
一般來說，應該按照生產商的說明使用磷酸酶。
1.在一個無菌的離心管中混合以下成分。
RNA 50ug
10X 磷酸酶緩沖液 5ul
DTT(100 mmol/L) 0.5ul
RNasin(40U/ul) 1.25ul
CIP(lU/ul) 3.5ul
H2O 至 50ul
2.50°C 溫育 1h。
3.加蛋白酶 K 至 50ug/ml，37°C 溫育 30 min。
4.用苯酚/氯仿抽提反應物，然后用氯仿再抽提一次。用 l/l0 體積的 3mol/L 乙酸鈉(pH5.2) 和 2.5 倍體積的無水乙醇沉淀 RNA，用 43.6ulH20 重溶 RNA。
5.取 2ug(1.6ul) 的 RNA 跑 1% 的瓊脂糖凝膠電泳（TAE)，相鄰的泳道點 2ug 的原始RNA 樣品，用溴化乙錠染色，以確認 RNA 在去磷酸化步驟中仍然是完整的。
第 2 階段：完整 RNA 去帽
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
ATP(100 mmol/L)
氯仿
乙酸鈉,3mol/L，pH5.2
乙醇
苯酚/氯仿 (1:1, 體積比）
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶緩沖液
RNasin
煙酸焦磷酸酶（TAP)，5U/ul
TAP 緩沖液，10X
3. 核酸和寡核苷酸
第 1 階段所得到的 RNA 樣品
4. 特殊設備
預設為 37°C 的水浴或加熱儀
5. 其他
瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包括溴化乙錠
二、方法
1. 在一個無菌的離心管中混合以下成分。
RNA(由第 1 階段第 5 步得到）38ul
TAP 緩沖液（10X) 5ul
RNasin(40U/ul) 1.25ul
ATP(100 mmol/L) 1ul
TAP(5U/u1) 1ul
H20 至 50ul
2.37°C 溫育 1h, 然后加 200ul 的 TE。
3. 用苯酚/氯仿抽提反應物，然后用氯仿再抽提一次。用 1/10 體積的 3mol/L 乙酸鈉(pH5.2) 和 2.5 倍體積的無水乙醇沉淀 RNA, 用 40ulH20 重溶 RNA。
4. 取 2ug 的 RNA 跑 1% 的瓊脂糖凝膠電泳（TAE)，相鄰的泳道點 2ug 的原始 RNA樣品，用溴化乙錠染色，以確認 RNA 在去帽步驟中仍然是完整的。
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