用顯微鏡多年，你調過柯勒照明嗎？

在任何特定光學顯微鏡設置中，柯勒照明技術都是實現最佳成像的最重要、最基本的技術之一。正確調節柯勒照明后，可以確保均勻的反差和照明、較高的分辨率以及更多細節，從而大幅改善圖像的質量。

　　盡管這項技術屬于設置顯微鏡的常規內容，但這項技術目前仍未在顯微鏡工作者中獲得廣泛實施。實際上，了解兩個主要顯微鏡部件(視場光闌和聚光鏡)后，完成正確設置就只是幾分鐘的事情了。

　　本文介紹了柯勒照明的主要原理，以及如何通過五個簡單步驟來進行調整。

　　August Koehler(1866-1948)

　　August Koehler于 1893 年發表了他發明的照明方法后，這項“柯勒照明”技術就以其名字予以命名了。柯勒的照明方法發表時，大多數顯微鏡都借助鏡子和煤氣燈作為照明光源。再加上顯微照相術，研究人員一度使用需要長時間曝光的乳膠板，這通常會導致成像的不一致性。

　　重要原理

　　即使今天，柯勒的均勻照明技術仍然被廣泛使用，并構成了共聚焦、相差以及微分干涉相差 (DIC) 顯微術等眾多技術的基礎。一旦您了解如何使用正確的柯勒照明來設置顯微鏡后，完成設置僅需不到一分鐘的時間，卻為成像效果帶來極大改善：這樣能夠確保光源均勻照射樣本，使圖像更清晰，并提高染色區域之間以及切片組織區域之間的反差。

　　如果您要在 PPT 演示、海報展示中使用圖像，或要將圖像提交給某家雜志，那么，柯勒照明是必須的。這個簡單的“五步走”技術將對您大有裨益。

　　在您實現柯勒照明過程中，除了顯微鏡物鏡之外，還需要注意并調節另外兩個部件。

　　視場光闌

　　“視場光闌”作為顯微鏡主體的一部分，通常位于底座(正置顯微鏡)之中，參見圖 1。視場光闌僅用于控制最終到達載物臺上載玻片的光量。控制光源發出的光量，即可減少由光源引發的眩光，從而確保圖像擁有更好的反差。

　　圖 1：正置顯微鏡的主要部件。視場光闌用于控制來自光源的光強。聚光鏡用于將光源發出的光聚焦在樣本上。孔徑光闌用于控制照明光錐。

　　聚光鏡

　　聚光鏡位于正置顯微鏡載物臺的正下方。在倒置顯微鏡中，則位于載物臺之上、光源和視場光闌的前面，如圖 1 所示。盡管聚光鏡配備調焦旋鈕，與顯微鏡的細調焦/粗調焦相似，但這個部件主要用于聚焦光源/視場光闌發出的光線，并不會對樣本進行聚焦。

　　“聚光鏡”用于收集光源的大部分光線，并將其作為成像光射線的光錐聚焦于顯微鏡載物臺的載玻片之上。準確調整該聚光鏡后，即可優化對樣本的照明效果和進入物鏡的光線。這樣就確保了最終圖像的均勻光強和反差。由于每個顯微鏡的物鏡都不同，這就意味著更改放大倍率時，應對聚光鏡予以調節。

　　聚光鏡中含兩個主要部件，您可以在設置正確柯勒照明的過程中，對這兩個部件進行調節。這兩個部件為：調中螺絲和光闌。與視場光闌一樣，聚光鏡也有一個控制光量的光闌。該光闌用于控制對樣本進行照明的光錐角度。整個顯微鏡系統的數值孔徑不僅僅是由物鏡決定的。當聚光鏡光闌打開時，整個儀器的數值孔徑會提高，使得分辨率和反差更佳且能夠實現最優照明效果。調中螺絲能夠確保用于照明載玻片的光線直接射入視場角的中心，因而保證了樣本周圍的均勻光強。

　　柯勒照明的五個步驟

　　第 1 步：

　　開始成像之前，請務必檢查透鏡、目鏡和物鏡是否干凈。將載玻片放在載物臺上，打開燈，并將其調至最低設定值。

　　第 2 步：

　　對樣本進行聚焦。首先，關小位于正置顯微鏡底座或倒置顯微鏡聚光鏡之上的視場光闌。俯身查看目鏡時，您剛好能看到載玻片上的小光圈，參見圖 2。

圖 2：關閉視場光闌。

　　第 3 步：

　　對聚光鏡進行調焦。當您坐在顯微鏡前時，調節聚光鏡的旋鈕通常位于調焦旋鈕的正前方。當您俯身查看目鏡時，緩慢地上下移動聚光鏡。此時，您將看到光圈的邊緣處于聚焦和未聚焦狀態，而且，光圈將從紅色條紋變成藍色條紋。盡可能將光圈的邊緣調節至最清晰狀態，參見圖 3。

圖 3：對聚光鏡進行調焦。

　　第 4 步：

　　一旦光圈清晰后，請將目光從目鏡上移開，并查看顯微鏡的聚光鏡部件。此時，您將看到調中螺絲。握住螺絲時，再次俯身查看目鏡。緩慢擰動螺絲時，您會看到光圈在視場中移動。您應該將光圈移動至樣本視場中間位置，參見圖 4。

圖 4：對聚光鏡進行調中。

　　對聚光鏡進行調中后，打開視場光闌直至光圈邊緣正好消失，參見圖 5。

圖 5：打開視場光闌。

　　第 5 步：

　　采用可變(或孔徑)光闌完成最終調整。在調中螺絲正下方(倒置顯微鏡則位于上方)，您會發現與視場光闌相似的另外一個光闌。當您俯身查看目鏡時，將其完全打開，然后逐漸關小該光闌，直至圖像眩光消失。關閉光闌時，樣本的反差將提高，而分辨率卻會降低。

　　以上就是實現柯勒照明的五個步驟了。

　　總而言之，這五個步驟就是：關小視場光闌、對邊緣進行調焦、調中光斑、開大光闌、減少眩光。

　　關于徠卡顯微系統Leica Microsystems

　　徠卡顯微系統是全球顯微科技與分析科學儀器之領導廠商，總部位于德國維茲拉(Wetzlar, Germany)。主要提供顯微結構與納米結構分析領域的研究級顯微鏡等專業科學儀器。自公司十九世紀成立以來，徠卡以其對光學成像的極致追求和不斷進取的創新精神始終得到業界廣泛認可。徠卡在復合顯微鏡、體視顯微鏡、數碼顯微系統、激光共聚焦掃描顯微系統、電子顯微鏡樣品制備和醫療手術顯微技術等多個顯微光學領域處于全球領先地位。

　　徠卡顯微系統在全球有七大產品研發與生產基地，在二十多個國家擁有服務支持中心。徠卡在全球一百多個國家設有區域分公司或銷售分支機構，并建有遍及全球的完善經銷商服務網絡體系。