用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態細胞方法

下面的簡單方案是Clhen等（1972）所用方法的變通方案，常用于成批制備感受態細菌，這些細菌可使每微克螺旋質粒ＤＮＡ產生5x106-2x107個轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規克隆的需要。該方法完全適用于大多數大腸桿菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重復性更好。該法制備的感受態細胞可貯存于-70℃，但保存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響。 
１）從于37℃培養16-20小時的新鮮平板中挑取一個單菌落（直徑２－３mm），轉到一個含有100ml LB或SOB培養基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養約３小時（旋轉搖床，300轉/分）。為得到有效轉化，活細胞數不應超過108細胞ml，可每隔20-30分種測量OD600值來監測培養物的生長情況。在菌株與菌株之間，ＯＤ600值和每毫升中活細胞數間的關系變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長周期的不同時相的ＯＤ600值，并將各黧度的增減物鋪于無抗生素的ＬＢ瓊脂平皿以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。 
２）在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至０℃。切記：下述所有步驟均需無菌操作。 
３）于４℃用Sorvall GS3轉頭（或與其相當的轉頭）以4000轉/分離心10分鐘，以回收細胞。 
４）倒出培養液，將管倒置１分釧以使zui后殘留的痕量培養液流盡。 
５）以10ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。我們發現將１mol/L CaCl2貯存液[用純水（Ｍille-Q級或與其相當的級別）配制]以10ml小份貯存于-20℃煞是方便。制備感受態細胞時，取一小份融化，用純水稀釋至100mlk，用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，然后驟冷到０℃即可。對于大多數大腸肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在這一步采用TFB（見表1.3）代替氯化鈣可得到相同的或更好的結果。 
６）于４℃以4000轉/分離心10分鐘，以回收細胞。 
７）倒出培養液，將管倒置１分鐘以使zui后殘留的痕量培養液流盡。 
８）每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，見表1.3和步驟５）注]重懸每份細胞沉淀。此時，可將細胞分成小份，放于-70℃凍存[有關討論請參見53頁本節（二）步驟11)b.c)]。在這些條件下，盡管長期保存后轉化效率會稍有下降，但細胞仍可保持處于感受態。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明細胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小時，在貯存的zui初12-24小時內，轉化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。 
９）用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加ＤＮＡ（體積∞10μl,ＤＮＡ∞50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。 
10）將管放到預加溫到42℃的循環水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。 
11）快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻１－２分鐘。 
12）每管加800μlＳＯＣ培養基（見附錄Ａ）。用水溶將培養基加溫至37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育45分鐘細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。如果要求更高的轉化效率，在復蘇期中，應溫和地搖動細胞（轉速不超過225轉/分）。 
13）將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和相應抗生素的ＳＯＢ瓊脂培養基上。如培養物體積太小（〈10μl）。可再加肉湯培養基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞涂到瓊脂平板表面。如在一個90mm平板上鋪200μl以上的感受態細胞，應離心濃縮細胞，然后用適量ＳＯＣ輕輕重懸細胞。如用四環素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上（或鋪在軟瓊脂中）。然而如選用氨芐青霉素抗性，則只能將一部分培養物（根據實驗決定）鋪在單獨的平皿上。氨芐青霉素抗性功的增加與平皿上所加細菌數的增加并無線性比例關系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長掏物質的緣故。 
14）將平板置于室溫直至液體被吸收。 
15）倒置平皿，于37℃培養，12-16小時后可出現菌落。如檢查氨芐青霉素抗性，用轉化細胞鋪增板時密度較低（每個90mm平板不超過104菌落），于37℃培養平板時不應超過20小時。氨芐青霉素抗性的轉化可將β－內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域中的抗生素。這樣，鋪平板時密度太高或培養時間太長都會導致出現對氨芐青霉素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。