用流式細胞儀分析利什曼病狗結腸細胞
實驗試劑
磷酸鹽緩沖液（PBS – NaCl; KH2PO4; Na2HPO4和蒸餾水）
HBSS
不完全和完全介質（小牛血清） Roswell Park Memorial Institute （RPMI）
肝素鈉鈉鹽，zui低99.5％滴定度，SIGMA-ALDRICH?
Ⅱ型膠原酶（Sigma＃S-7900）
BSA（牛血清白蛋白）
Azida 2mM
實驗設備
剪刀
鉗子
培養皿
1.5，2.0，15和50mL試管
熱孵化器（振蕩器）
細胞培養離心機（Thermo Scientific multifuge X3R）
巴斯德吸管
實驗步驟
1．除去結腸穿孔活檢分離固有層細胞，在無菌培養皿中用不完全介質（RPMI）徹底清洗整個結腸清除糞便，將結腸片段轉移到另一個含有10mL完整的介質的培養皿中，置于冰上。
2．用小鑷子，手術剪除去結腸片段中的脂肪是細胞分離的關鍵步驟。
3．將樣品放在無菌培養皿中緩慢攪拌10分鐘，用巴斯德吸管取出上清液并棄掉，這個過程重復六次。
4．將組織碎片轉移到含10mL培養液（DTT）的培養瓶中，37℃，震蕩30分鐘（120RPM），棄掉培養液，這一步持續30分鐘。
5．加入10mL洗滌液，37℃（（HBSS/HEPES）震蕩10分鐘（120RPM），洗去組織碎片中的DTT。
6．關鍵的一步：從結腸組織中的除去膠原蛋白這個過程是必不可少的。
7．這一步后，組織碎片中加入10ml膠原酶溶液，37℃搖輕輕振動篩（120RPM）45分鐘。
8．45分鐘后吸取出膠原酶溶液上清，轉移到 Falcon? 15mL試管中。在4℃離心上清10分鐘（1400RPM），加入0.5μL完全介質重懸浮，置于冰上。所有這些步驟必須重復四次。
9．細胞放在一個 Falcon? 15mL試管中，加入9ml蒸餾水溶解紅細胞，10秒后加入1mlPBS中和這一步。之后4℃離心10分鐘后（1400RPM），用0.5μL完全培養基重懸浮顆粒。
10．使用 Neubauer相機分析10μL樣本中細胞數量，細胞數量應校準到1×107細胞/ ml。細胞可以阻斷陰性利什曼犬血清，置于冰上至少20分鐘。
11．利用臺盼藍染料（0.4% （wt/vol） in HBSS）鑒別細胞活力。這個反應是基于事實，除非膜損壞臺盼藍不與細胞相互作用。
12．稀釋抗體淺標記ADS，胞內標記物在透化性緩沖溶液內。
13．將濃度1×107個細胞/ mL細胞懸液（20μL）放于96孔U型底板（Limbro Biomedicals? 175, Aurora, OH, USA）在細胞表面加入抗體。
14．將96孔板冷藏15分鐘，之后每孔加入150μL預冷的 PBS， 4oC（1300RPM）離心10分鐘，棄掉上清。加入2％的甲醛200μL固定細胞。
15．將細胞加入到流式細胞儀管（熒光激活細胞），避光儲存在冰箱中。
16．移去上清液胞內標記物，加入150μL PBS-w， 4oC1300RPM離心樣品10分鐘，再次移出上清液。新增的透化性緩沖液（150μL）；慢慢的混合樣品，室溫環境下保持10分鐘。再次離心10分鐘（4℃，1300RPM），除去上清液。
17．加入細胞內抗體包括亞類室溫下孵育40分鐘，加入透化性緩沖液（150μL），離心樣品去除上清液。這個過程可以重復一次。
18．加入150μL PBS-W重懸細胞，離心去除上清液，加入200μL 2％的甲醛將細胞移至流式細胞儀管，避光儲存于在冰箱中。
19．用流式細胞儀分析細胞。激光發光在488nm（FACSVantage?, Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA）。
20．評估結腸固有層細胞單核細胞表型的固有層細胞數量，兩種不同的形式表達，一個給定的表型標記的細胞百分比（％），用細胞和亞型對照終止，具有雙峰分布和幾何平均熒光強度（MFI）。后者方法用單峰分布表型標記的半定量表達。平均熒光強度和頻率的基礎上，三色流式細胞儀優化用于狗結腸亞型單核細胞表型。分析細胞應側重于亞群細胞的組成，這些細胞是：CD4，CD4FOXP3，CD8，CD11b，CD11c，TLR9，TLR2，CD14和甘露糖。這為比較狗利什曼病粘膜的各種臨床狀態提供了一個機會。