一、材料
1. 緩沖液和溶液
氯仿
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0) 或 EGTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0) (如使用 CIP)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
SDS (10% m/V）( 如使用 CIP)
醋酸鈉（3 mol/L，pH 7.0 [ 如使用 CIP] 和 pH 5.2)
TE ( pH 7.6)
Tris-Cl（1 mol/L，pH 8.5)
2. 酶和緩沖液
牛小腸堿性磷酸酶（CIP) 或蝦堿性磷酸酶（SAP) (US Biochemical 公司， Boehringer Mannheim 公司或 Worthington Biochemicals 公司）
10X CIP 去磷酸化緩沖液或 10X SAP 去磷酸化緩沖液
蛋白酶 K
限制性內切核酸酶
3. 核酸和寡核苷酸
DNA 樣品（0.1~10 μg [ 1-100 pmol]）
4. 專用設備
預先設定至 56℃、65℃ 或 75℃ (CIP) 或 70℃ (SAP) 水浴或加熱板
二、方法
1. 用所選擇的限制性內切核酸酶完全消化 1~10 μg (10~100 pmol) DNA 使去磷酸化。
2. 用 CIP 或 SAP 使已經限制酶切的 DNA 5' 端去磷酸化。
(1) 用 CIP 進行 DNA 的去磷酸化
① 向 DNA 中加入：
10X CIP 去磷酸化緩沖液 5 μl
水 加至 48 μl
② 加入適量的 CIP。
③ 37℃ 溫育反應 30 min 后，加入第二等份 CIP，繼續溫育 30 min。
④ 在溫育反應結束后，加入 SDS 和 EDTA（pH 8.0) 至終濃度分別為 0.5% 和 5 mmoI/L 以滅活 CIP，充分混勻備試劑，再加入蛋白酶 K 至終濃度為 100 μg/ml，56℃ 下溫育 30 min。
⑤ 將反應冷卻至室溫，先用酚: 氯仿抽提 2 次，再以氯仿單獨抽提 1 次以純化 DNA。
(2) 用 SAP 進行 DNA 去磷酸化
① 向 DNA 中加入：
10X SAP 去磷酸化緩沖液 5 μl
水 加至 48 μl
② 加入適量的 SAP。
③ 37℃ 溫育反應 1 h。
④ 為滅活 SAP，將反應轉移至 70℃ 加熱 20 分鐘，然后冷卻至室溫。
3. 將水相轉移至一個清潔的微量離心管中，如用 SAP，則在 0.1 體積的 3 mol/L 醋酸鈉（pH 5.2) 的存在下用標準乙醇沉淀回收 DNA；如使用 CIP，則用 0.1 體積的 3 mol/L 醋酸鈉（pH 為 7.0）。
4. 室溫下干燥沉淀物，然后溶于 TE (pH 7.6)，使 DNA 的濃度 > 2 nmol/ml。
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