用蛋白質底物進行蛋白質激酶分析實驗——酪氨酸激酶

烯醇化酶酪氨酸激酶分析緩沖液

1. 制備酸變性的烯醇化酶

從兔肌肉中純化的烯醇化酶通常以硫酸銨沉淀或者懸液的形式存在。

(1) 含 100 μg 的烯醇化酶，于 4℃ 全速離心 5 分鐘。

(2) 去上清，加入含有 1 mmol/L DTT 的 10 μl 50 mmol/L HEPES 緩沖液（pH 7.0)，徹底混勻，冰浴 30~60 分鐘。

(3) 加 10 μl 甘油，混勻，如果當天進行分析實驗就放在冰上。

(4) 馬上分析前，往烯醇化酶溶液加 20 μl 100 mmol/L 乙酸，徹底混勻。于 30℃ 水浴 5 分鐘，然后放在冰上。

2. 在冰浴的離心管內配制如下 20 μl 反應混合物：

5X 酪氨酸激酶分析緩沖液                             4 μl 

酸變性的烯醇化酶                                        1 μl

[γ-³²P] ATP（終濃度 5 μCi/5 μmol/L ATP）    1 μl

水（取決于下一步所加的激酶樣品的量）        0~14 μl

5X 酪氨酸激酶分析緩沖液：

100 mmol/L HEPES (pH 7.4)

5 mmol/L MnCl₂

5 mmol/L DTT

500 μmol/L Na₃VO₄

3. 加入 1~14 μl 激酶樣品開始反應。

4. 于 30℃ 繼續反應一定時間，然后加入 20 μl 冰冷的 2X SDS-PAGE 加樣緩沖液終止反應。混勻后，沸水浴煮 3 分鐘。然后可以用于 SDS-PAGE 分析、TCA 沉淀計數和/或放射自顯影檢測。