用隨機寡核苷酸延伸法進行扣除cDNA探針的放射性標記

大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 反轉彔酶 隨機脫氧核苷酸引物 模板 mRNA

二硫基蘇糖醇 乙醇 EDTA NaOH 胎盤 RNA 酶抑制劑 隨機引物緩沖液 醋酸鈉 dNTP 溶液

Sephadex G-50 離心柱 微量離心管 水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

二硫基蘇糖醇（DTT) (1 mol/L）

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

HCl ( 2.5 mol/L)

NaOH ( 3 mol/L)

酚：氯仿（1:1，V/V)

胎盤 RNA 酶抑制劑

5X 隨機引物緩沖液（250 mmol/L Tris ( pH 8.0)，25 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L DTT，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 調至 pH 6.6)，使用 1 mol/L DTT 貯存液的新稀釋水溶液，貯存于 -20℃。用后棄去稀釋的 DTT。）

SDS ( 20% m/V)

醋酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)

Tris-Cl (1 mol/L，pH 7.4)

2. 酶與緩沖液

大腸桿菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

反轉彔酶

10X 反轉錄酶緩沖液

3. 核酸與寡核苷酸

含 4 種 dNTP 各 5 mmol/L 的（完全）dNTP 溶液

含 dCTP、dGTP 和 dTTP 各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液

oligo (dT)_12-18

長度為 6 或 7 個堿基的隨機脫氧核苷酸引物

模板 mRNA

4. 放射性復合物

[α-³²P] dATP ( 10 mCi/ml，比活性為 >3000 Ci/mmol）

[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性為 800~3000 Ci/mmol）

5. 專用設備

Sephadex G-50 離心柱，平衡于 TE（pH 7.6)

硅化的微量離心管（1.5 ml）

預熱至 45℃、60℃ 和 68℃ 的水浴

二、方法

1. 4℃ 下在一個滅菌的微量離心管中混合下列成分以合成 cDNA 第一鏈：

模板 RNA (1 mg/ml）                 10 μl

oligo(dT)_12-18 （1 mg/ml）         10 μl

5 mmol/L dNTP（完全）溶液      10 μl 

50 mmol/L DTT                           1 μl 

10X 反轉錄緩沖液                        5 μl

10 mCi/ml [α-32P] dCTP              5 μl

( 比活性 800 或 3000 Ci/mmol）

胎盤 RNA 酶抑制劑                     25 單位

無 RNA 酶的水                           加至 46 μl

反轉錄酶（~800 單位）               4 μl

2. 檢測放射性標記的 dNTP 摻入 TCA 可沉淀物或結合于 DE-81 濾膜的比率。用下列公式計算 cDNA 第一鏈的產率。



3. 加入下列試劑以終止反應：

0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)     2 μl

20% (m/V) SDS                 2 μl

充分混勻微量管中的各成分。

4. 在反應管中加入 5 μl 3 mol/L NaOH，于 68℃ 溫育反應 30 min 以水解 RNA。

5. 將反應物溫度冷至室溫。加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl (pH 7.4)，充分混勻以中和溶液，然后加 5 μl 2.5 mol/L HCl。點一小滴溶液（<1 μl）在 pH 試紙上以檢測溶液的 pH。

6. 用酚:氯仿抽提純化 cDNA。

7. 用 Sephadex G-50 離心柱層析分離放射性標記的探針與未摻入的 dNTP。

8. 進行兩輪扣除雜交。

9. 用異丁醇序貫抽提濃縮 cDNA，通過 Sephadex G-50 層析除鹽。

10. 用標準乙醇沉淀回收 cDNA。將 cDNA 溶于水，終濃度為 15 ng/μl。

11. 為了對扣除 cDNA 進行高比活性的放射標記，在一個 0.5 ml 微量離心管中混合下列成分：

扣除 cDNA                                     5 μl

隨機脫氧核苷酸引物（125 μg/ml）   5 μl

12. 加熱混合物至 60℃ 5 min，然后冷卻到 4℃。

13. 向引物：cDNA 模板混合物中加入：

5X 隨機引物緩沖液               10 μl

含 dCTP、dGTP 和 dTTP

各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液    5 μl

10 mCi/ml [α-³²P] dATP

( 比活性為 >3000 Ci/mmol） 25 μl

Klenow 片段（12.5 單位）    2.5 μl

水                                       加至 50 μl

室溫下反應 4~6 h。

14. 加入下列試劑以終止反應：

0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)   1 μl

20% (m/V) SDS                2.5 μl

15. 用 Sephadex G-50 離心柱層析分離放射性標記的 cDNA 與未摻入的 dNTP。