用S190抽提物進行染色質重組實驗

S-190 抽提物核心組蛋白DNA模板

緩沖液 RATP 混合物MgCl2CaCl2微球菌核酸酶儲液EDTARnase A糖原終止緩沖液蛋白酶 K酚 氯仿 異戊醇Tris· Cl乙酸銨乙醇瓊脂糖凝膠TBE 緩沖液DNA 梯度

水浴鍋

1. 實驗前準備

1.1 材料

S-190 抽提物

核心組蛋白

1.2 試劑

緩沖液 R

ATP 混合物

0.1mol/L MgCl₂

DNA模板（2.5～25 kb 環狀或線性化質粒，或 λDNA）

0.1mol/L CaCl₂

200 U/ml 微球菌核酸酶儲液

0～5 mol/L EDTA

10 mg/ml Rnase A

糖原終止緩沖液

2.5 mg/ml 蛋白酶 K

50：49：1（V/V/V）酚/氯仿/異戊醇，用 10 mmol/L Tris· Cl， pH 8.0 平衡

2.5 mol/L 乙酸銨

70％ 和 100％ 乙醇

1.2％（m/V）瓊脂糖凝膠

TBE 緩沖液

123 bp DNA 梯度（Life Technologies）

1.3 儀器耗材

27℃ 和 37℃ 水浴步驟

2. 混合 40 ul 緩沖液R、190 抽提物及核心組蛋白。室溫孵育 30 min。

3. 加入 10 ul ATP 混合物，0.1 mol/L MgCl₂ 至終濃度為 7 mmol/L， 500 ng DNA 模板。27℃ 水浴 5 h。如有需要，用緩沖液 R 補齊至100 ul。

4. 加入 3 ul 0.11 mol/L CaCl₂ 至組裝反應體系中。將反應液等分為兩份（a 和 b）。用緩沖液R按 1：50 和 1：150 稀釋微球菌核酸酶（200 U/ml）。

5. 隔一定的時間間隔（如 15 s ），在 a 管中加入 5 ul 1：150稀釋液，在 b 管中加入 1 ： 50 稀釋液。室溫消化 10 min。

6. 加入 7 ul 0.5 mol/L EDTA 終止反應的進行。加入 1 ul 10 mg/ml 的 RNase A 溶液， 室溫孵育 10 min。

7. 每個反應中加入 95 ul 糖原終止緩沖液，5 ul 2.5 mg/ml 的蛋白酶 K 溶液。37℃ 溫育 30 min。

8. 使用 200 ul 50:49:1 酚/氯仿/異戊醇抽提。取出 150 上層水相加入15 ul 2.5 mol/ L 乙酸銨、450 ul 100％ 乙醇沉淀 DNA。室溫以最大轉速離心 15 min，用 200 ul 70％ 乙醇洗滌沉淀。室溫以最大轉速離心 5 min，在空氣中干燥 5 min。

9. 用 6 ul 凝膠上樣緩沖液重懸沉淀，在 1×TBE，電壓約 5～10 V/cm 進行 1.2％ 瓊脂糖凝膠電泳。使用 123 bp DNA梯度作為分子質量指標。用溴化乙錠染色。