用PCR識別不同的噬菌體抗體克隆

。不過，也可以先用PCR篩選方法估計所出現的不同克隆的數目。使用位于scFv基因旁側的引物，直接從包含了噬菌粒的細菌克隆中擴增scFv。然后，用能多次切割V基因的限制性酶（如BstNI）消化PCR產物。盡管這對于來自非免疫文庫的scFv很有效，但對于多樣性受到更多限制的抗體文庫效果較差。這是因為這些抗體文庫中的多樣性并非意味著限制性位點的增加或減少。一般而言，有不同限制性模式的scFv代表著各自獨特的克隆。但具有相同模式的scFv也可能代表著不同的克隆（大約有10％的概率）。這起因于以下事實：BstNⅠ（和其他酶）一般切割V基因的框架區，因此結果更傾向于表示某個V_H家族或成員，同某個V_L家族或成員相配對。認真對指紋類型進行檢查，也可以發現哪些克隆被部分消化。這會表現為大量常見條帶伴隨一些額外的條帶，其強度有時并不與其他條帶一致；或者條帶長度累加也不與起始PCR產物的一致。在消化之前，將PCR產物的一份等量樣本在膠上進行電泳是有用的。這將核實結合性抗體是否是全長。有時結合性單個結構域（VH）抗體也可從噬菌體文庫中選擇出來。

[器材和試劑]

●  BstNⅠ限制性酶和緩沖液（New England Bi01abs）

●  引物

●  PCR試劑和設備

●  礦物油（Sigma）

●  Nusieve瓊脂糖

●  10×TBE緩沖液[為準備10×TBE緩    沖液，在900ml水中溶解108g Tris和55g硼酸；加入40ml 0．5mol／L EDTA（pH 8．0），并用水加至1L）

[方法]

1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ul PCR混合液，  包含：

●  水，15．5ul

●  10XRT緩沖液，2．0ul

●  5mmol／L dNTP，  1．0ul

●  5^，引物，1．0ul

●  3^，引物，1．0ul

●  Taq聚合酶，0.2ul

如果PCR緩沖液中不含Mg2+，這應加至終濃度為1．5mmol／L。也可以使用與DNA聚合酶配套供應的PCR試劑。

2．取20fLl主混合液加到0．5m1管內，或加入96孔PCR微孔板孔內。

3．用l根牙簽輕輕接觸單個克隆并在PCR反應液中轉動，注意不要轉移太多材料。如在PCR反應液中有過量細菌，會抑制PCR反應。扔掉牙簽；或如有需要，用它在1個單獨的96孔培養孔板內培養基救援該克隆；或者在瓊脂平板上接觸表面。用1～2ul甘油儲存料或主板培養液，也可以代替相應克隆。

4．反應液上鋪上礦物油。

5．用PCR儀格內加熱試管或孔板至94℃，10分鐘。裂解細菌使其釋放模板DNA。然后，以94℃1分鐘、55～60℃1分鐘（對于Fab片段文庫的篩選則為2分鐘）、72℃ 1分鐘的條件孵育，共循環30次。

6．建議在PCR后取5ul PCR反應產物在2％瓊脂糖膠上檢測。這將顯示有多少克隆包含全長的插入序列。

7．PCR后，在礦物油下面加入20ul主混合液，成分如下：

●  乙酰化BSA（10mg／ml），  0．2ul

●  BstNⅠ緩沖液（10×），4．0ul

●  水，15．3ul

●  BstNⅠ （10U／ul），0．54ul

8．60℃孵育樣本2～3小時。

9．將2ul樣本染液與8ul反應混合物（取自礦物油下面）混合并在4％Nusieve瓊脂糖膠上電泳；此膠用含0．05ug／ml溴化乙錠的0．5倍TBE緩沖液配制。或者是用2．5％瓊脂糖膠電泳（此膠的分辨率較低）。

10．以100V（10V／cm）跑膠并在UV transillu minator上比較各種不同的單獨克隆的帶型。